Předmět Moderní metody buněčné biologie (Bi6725)

Na serveru studentino.cz naleznete nejrůznější studijní materiály: zápisky z přednášek nebo cvičení, vzorové testy, seminární práce, domácí úkoly a další z předmětu Bi6725 - Moderní metody buněčné biologie, Přírodovědecká fakulta, Masarykova univerzita (MU).

Materiál	Typ	Datum	Počet stažení

Cíl

Na konci tohoto kurzu bude student schopen:provádět rutinně klasické i moderní techniky používané v základním i aplikovaném výzkumu (viz sylabus);využít metody a přístupy odrážející nejnovější trendy ve výzkumu molekul, specifických buněk a buněčných populací;použít získané manuální laboratorní dovednosti a dále je rozvíjet;vybrat si ze spektra technik tu nejvhodnější metodu podle znalostí získaných v rámci předmětu;pracovat v moderně vybavených pracovištích na základě zkušeností z práce v laboratořích Biofyzikálního ústavu AV ČR, v.v.i.;získat praktické znalosti využitelné při vypracovávání diplomových a dizertačních prací

Osnova

1. Buněčné kulturyStanovení počtu a viability buněk: ukázka vybavení laboratoře, obsluha flow boxu, typy plastů pro buněčné kultury, bezpečnost práce, pasážování buněk, počítání částic na Coulter Counter, určení životnosti buněk barvením eosinem.Detekce apoptotických buněk: stanovení apoptotického indexu - barvení pomocí DAPI (fluorescenční detekce buněk s kondenzovaným a fragmentovaným chromatinem). Měření mitochondriálního membránového potenciálu apoptotických buněk pomocí barvení TMRE (tetrametyl rhodamin etylester) a detekce průtokovou cytometrií.Stanovení stupně diferenciace leukemických buněk: detekce povrchových molekul CD11b a CD14 u buněk myeloidní linii HL-60 průtokovou cytometrií pomocí přímé imunocytochemie s protilátkami značenými fluorescenčními barvivy. Stanovení míry oxidativního vzplanutí jako ukazatele diferenciace u buněk HL-60 za použití různých aktivátorů fagocytózy (zymosan, forbol myristat acetat, Ca2+ ionofor) na destičkovém luminometru.Stanovení diferenciace buněk nádoru kolonu (linie HT-29): stanovení alkalické fosfatázy kolorimetricky (alkalická fosfatáza štěpí bezbarvý substrát 4-p-nitrofenyl fosfát za vzniku žlutého zbarvení).2. Fluorescenční a konfokální mikroskopie:Princip funkce fluorescenčního mikroskopu (výhody a limitace), rozdíly mezi konvenční a konfokální mikroskopií. Pozorování trojrozměrně fixovaných interfázních jader, ve kterých je fluorescenčně značený gen a jinou fluorescenční značkou obarven celý chromozom, na kterém se daný gen nachází.3. Biochemické metody:Příprava buněčného lyzátu pro Western blotting a izolaci RNA:Metodika přípravy buněčného lyzátu pro detekci proteinů a pro izolaci RNA, stanovení koncentrace proteinů pomocí kitu Bio-Rad DC protein.Elektroforéza a transfer proteinů na membránu: separace stanoveného množství proteinů připravených v rámci předchozího cvičení pomocí SDS-PAGE, přenos na PVDF membránu pomocí semidry electroblotting.Imunodetekce:Imunodetekce beta-aktinu pomocí primární neznačené protilátky (anti-beta-aktin) a sekundární protilátky značené křenovou peroxidázou ve vzorcích zpracovaných a separovaných v rámci předchozích cvičení, vizualizace bude provedena pomocí kitu ECL Plus.Izolace celkové RNA, stanovení koncentrace a kvality:Izolace RNA z připraveného buněčného lyzátu pomocí komerčního kitu, stanovení koncentrace RNA a její čistota na přístroji Nanodrop ND-1000 Spectrophotometer.ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) metoda:Stanovení tumor nekrotizujícího faktoru alfa pomocí komerčního kitu od firmy R&D system Duoset v médiu získaného z diferencovaných myeloidních buněk THP-1 po aplikaci endotoxinu v různých koncentracích po dobu 24 hodin.

Literatura

Cell culture and upstream processing. Edited by Michael Butler. 1st ed. New York: Taylor & Francis, 2007. xiv, 187 s. ISBN 0415399696. infoMammalian cell culture :essential techniques. Edited by A. Doyle - J. Bryan Griffiths. [1st ed.]. Chichester: John Wiley & Sons, 1997. 173 s. ISBN 0-471-97057-3. infoCancer cell culture :methods and protocols. Edited by Simon P. Langdon. Totowa, N.J.: Humana Press, 2004. xii, 360 s. ISBN 1-58829-079-4. infoAnimal cell culture :a practical approach. Edited by R. Ian Freshney. 2nd ed. Oxford: Oxford University Press, 1992. xix, 329 s. ISBN 0-19-963213-8. infoMethods in cell biology :cell biological appplications of confocal microscopy. Edited by Brian Matsumoto. 2nd ed. Amsterdam: Academic Press, 2002. xii, 507 s. ISBN 0-12-580445-8. infoMolecular cloning, A laboratory manual, Vol. 1-3, Eds. J. Sambrook and D. W. Russell, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York 2001Short protocols in molecular biology, Vol. 1 and 2, 5th edition, John Wiley and Sons, Inc., 2002Current protocols in cytometry, Vol. 1 and 2, Ed. J. P. Robinson, John Wiley and Sons, Inc., 1997Methods in Cell Biology, Vol. 75, Cytometry, 4th edition, New developments, Eds. Z. Darzynkiewicz, M. Roederer, H. J. Tanke, Elsevier Academic Press, 2004ELISA guidebook. Edited by John R. Crowther. 1st ed. Totowa: Humana Press, 2001. xi, 421 s. ISBN 0-89603-950-1. info

Požadavky

Bi3030 Fyziologie živočichů Předmět navazuje a tvoří logický celek s cvičením Fyziologie živočichů a Speciální metody fyziologie živočichů.

Garant

prof. RNDr. Alois Kozubík, CSc.

Vyučující

prof. RNDr. Alois Kozubík, CSc.prof. RNDr. Jiřina Hofmanová, CSc.Mgr. Jiřina Medalová, Ph.D.Mgr. Karel Souček, Ph.D.doc. RNDr. Jan Vondráček, Ph.D.