Předmět Metody v genomice a proteomice (CG080)

Na serveru studentino.cz naleznete nejrůznější studijní materiály: zápisky z přednášek nebo cvičení, vzorové testy, seminární práce, domácí úkoly a další z předmětu CG080 - Metody v genomice a proteomice, Přírodovědecká fakulta, Masarykova univerzita (MU).

Materiál	Typ	Datum	Počet stažení

Cíl

Na konci tohoto kurzu bude student schopen:vysvětlit principy základních metod pro studium genomu a proteomu; bude schopen navrhnout vhodný metodický postup pro analýzu daného typu vzorku s ohledem na účel analýzy

Osnova

genomikaIzolace DNA a RNA, Separace nukleových kyselin (elektroforéza)Metody izolace DNA/RNA: fenol/chloroformové extrakce, izopyknické centrifugace v gradientu CsCl či adsorbce na křemičité sklo v přítomnosti chaotropních solí. Metody kvatifikace (komparativní, spektrofotometrické). Specifika práce s komerčně dostupnými kity na izolaci DNA/RNA. Metody používané při separaci nukleových kyselin se zaměřením na gelovou elektroforézu (agarózová, akryamidová). Principy a separační vlastnosti gelů; méně používané typy elfo (např. low-melting a alkalické agarózy; denaturující či nedenaturujíci akrylamidové gely; PFGE, 2D elfo). Možná úskalí („troubleshoots“ jak izolace DNA/RNA tak elfo separace) a interpretace výsledků.Manipulace s DNA (štěpení, klonování, značení, ...) - enzymy používané v molekulární biology (restrikční endonukleázy typu I, II, III; metylačně citlivé enzymy, izoschizomery). Vektory (bakteriofágy, plasmidy, cosmidy, umělé bakteriální a kvasinkové chromozómy). Klonování do plasmidu (ligace s tupými a kohezními konci, transformace s použitím chemicky kompetentních buněk, transformace elektroporací, screening). Radioaktivní a neradioaktivní metody značení nukleových kyselin.Techniky založené na renaturaci DNA (Southern, northern, PCR, FISH, microarrays...) Princip analýzy DNA (Southern) a RNA (northern); specifika práce s RNA. Design experimentu – štěpení DNA metylačně citlivými restriktázami, elektroforéza, přenos DNA na membránu, značení sondy, hybridizace, interpretace výsledků.PCR – princip, historie, DNA polymerázy. Optimalizace PCR, PCR s teplotním gradientem. FISH – princip, použití, značení sond fluorescenčními barvivy. Fibre FISH, multiplex FISH, RNA FISH, barvení repetitivních sekvencí (centromery, telomery), použití v diagnostice.Microarrays – princip, výhody pro sériovou analýzu genové exprese, interpretace výsledků.Sekvenování, analýza genové exprese – principy sekvenování (chemické, Sangerovo), automatické kapilární sekvenátory, moderní sekvenační platformy (next-generation sequencing). Analýza genové exprese na úrovni mRNA a proteinů, přístupy in vitro a in vivo. Alternativní sestřih a jeho analýza. RT-PCR v reálném čase a cDNA microarrays.Mutanti a jejich využití v genomice: Základní přístupy funkční genomiky, přímá a revezní genetika. Inzerční mutageneze v přímé i reverzní genetice, EMS mutageneze, identifikace mutovaných lokusů pomocí pozičního klonování a sekvencování příští generace (next-gen sequencing). EMS mutageneze v reverzní genetice - tilling.proteomikaPříprava proteinových izolátů a frakcionace/separace proteinů a peptidů - základní metody izolace proteinů z různých typů vzorků; elektroforetické separační techniky (IEF, SDS-PAGE, 2-D gelová elektroforéza, DIGE, aj.); kapalinově chromatografické techniky; separační postupy pro analýzu fosfoproteinů a glykosylovaných proteinů, vícerozměrné postupy pro analýzu komplexních proteinových vzorkůHmotnostní spektrometrie proteinů - základní typy ionizace (ESI a MALDI) a MS instrumentace (TOF, iontová past, FTMS, hybridní přístroje); metody identifikace proteinů; charakterizace modifikací proteinů; metody kvantifikace (relativní a absolutní kvantifikace)analýza proteinových komplexů (izolace komplexů, cross-linking, analýza, ověření); následná a paralelní analýza, metody studia interakce protein-protein (Y2H; BiFC; mbSUS; MeRA; SEAM – značení myc, TAP, FLAG, His; využití iontové mobility); stechiometrie komplexů - kvantifikace proteinů a peptidů pomocí MS; struktura komplexů - zesíťování molekulárními pravítky, metody (FTICR MS)Metody makromolekulární strukturní analýzy - krystalografické techniky, NMR, cirkulárně dichroická spektroskopie - výhody a nevýhody; základní postupy proteinové krystalografie - makromolekulární krystalizační techniky, difrakční experiment, fázový problém a metody jeho řešení, mapy elektronové hustoty, strukturní model a jeho zpřesňování.Příprava rekombinantních proteinů – výběr hostitelského organismu pro expresi rekombinantních proteinů; expresní systém E.coli; struktura expresního vektoru; výběr hostitelského kmene E.coli s ohledem na možné problémy jako toxicita proteinu, využití kodonů, stabilita proteinu; cílená exprese proteinu; inkluzní tělíska a možnosti optimalizace exprese proteinu v rozpustné formě; zásady pro čištění proteinů; základni typy chromatografií; sledování čistoty proteinů; fúzní proteiny; afinitní purifikace; uchovávání čistých proteinů.

Literatura

doporučená literaturaDiscovering genomics, proteomics and bioinformatics campbell. ISBN 9780805382198. infoEvolutionary genomics and systems biology. Edited by Gustavo Caetano-Anolles. Hoboken, N.J.: Wiley-Blackwell, 2010. xix, 465 p. ISBN 0470195142. infoPEVSNER, Jonathan. Bioinformatics and functional genomics. 2nd ed. Hoboken, N.J.: Wiley-Blackwell, 2009. xxviii, 95. ISBN 978-0-470-08585-1. infoBUDINSKA, Eva , Otakar FOJT a Ladislav DUŠEK . Bioinformatics in Genomics and Proteomics Data. 2009. URL infoBiotechnology and genomics. Edited by P. K. Gupta. 1st ed. Meerut, India: Rastogi Publications, 2009. 796 p. ISBN 9788171338450. infoTWYMAN, R.M. Principles of proteomics. : BIOS Scientific Publishers, 2008. ISBN 1 85996 273 4. infoEIDHAMMER, Ingvar. Computational methods for mass spectrometry proteomics. Chichester, England: John Wiley & Sons, 2007. x, 284 p. ISBN 0470512970. infoGenomics. Edited by Isidore Rigoutsos - G. Stephanopoulos. New York: Oxford University Press, 2007. xxi, 314 p. ISBN 9780195300819. infoMass spectrometry data analysis in proteomics. Edited by Rune Matthiesen. Totowa, N.J.: Humana Press, 2007. x, 320 p. ISBN 9781588295637. infoPlant proteomics :methods and protocols. Edited by Herve Thiellement. Totowa, N.J.: Humana Press, 2007. xiii, 399. ISBN 978-1-59745-227-4. infoFunctional genomics :methods and protocols. Edited by Michael J. Brownstein - Arkady B. Khodursky. Totowa, N.J.: Humana Press, 2003. xii, 258 s. ISBN 1-58829-291-6. infoSIMPSON, Richard J. Proteins and proteomics :a laboratory manual. Cold Spring Harbor, N.Y.: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2003. xiii, 926. ISBN 0-87969-554-4. infoPosttranslational modifications of proteins :tools for functional proteomics. Edited by Christoph Kannicht. Totowa, N.J.: Humana Press, 2002. xi, 322 s. ISBN 0-89603-678-2. infoProteomics. Edited by Timothy Palzkill. New York: Kluwer Academic Publishers, 2002. viii, 127. ISBN 0-306-46895-6. infoFunctional genomics :a practical approach. Edited by Stephen P. Hunt - Rick Livesey. 1st ed. Oxford: Oxford University Press, 2001. xviii, 253. ISBN 0-19-963774-1. infoComparative genomics :empirical and analytical approches to gene order dynamics, map alignment and the evolution of gene families. Edited by David Sankoff - Joseph H. Nadeau. 1st ed. Dordrecht: Kluwer Academic Publishers, 2000. xiii, 557. ISBN 0-7923-6584-4. info

Požadavky

základní znalosti analytické chemie, biochemie a molekulární biologie

Garant

prof. RNDr. Zdeněk Glatz, CSc.

Vyučující

Mgr. Radka Dopitová, Ph.D.prof. RNDr. Jiří Fajkus, CSc.Mgr. Miloslava Fojtová, CSc.doc. Mgr. Jan Havliš, Dr.doc. RNDr. Jan Hejátko, Ph.D.doc. RNDr. Jaromír Marek, Ph.D.doc. Mgr. Jan Paleček, Dr. rer. nat.Mgr. Petra Procházková Schrumpfová, Ph.D.doc. RNDr. Zbyněk Zdráhal, Dr.