Předmět Fluorescenční mikroskopie v buněčné biologii (MB151P96)

Na serveru studentino.cz naleznete nejrůznější studijní materiály: zápisky z přednášek nebo cvičení, vzorové testy, seminární práce, domácí úkoly a další z předmětu MB151P96 - Fluorescenční mikroskopie v buněčné biologii, Přírodovědecká fakulta, Univerzita Karlova v Praze (UK).

Materiál	Typ	Datum	Počet stažení

Cíl

Absoventi získají informovaný přehled o nejužívanějších technikách moderní fluorescenční mikroskopie a budou schopni účelně použít fluorescenční mikroskop pro buněčně biologická pozorování. Absolvent by měl být schopen samostatně rozhodnout, jaký přístup použije pro pozorování konkrétního preparátu, jaké informace je možno ze získaných dat vyčíst, a dokáže tyto interpretovat s vědomím hlavních zdrojů možných chyb.

Sylabus

Fluorescenční mikroskopie v buněčné biologii(syllabus přednášky; 2/0)1. Základy mikroskopie - princip mikroskopu, zvětšení, limity zobrazení (Airyho disk, Rayleighovo kritérium). Práce s mikroskopem - Köhlerovo osvětlení a jak ho nastavit, olejová imerze, druhy objektivů, fázový kontrast, diferenciální interferenční kontrast.2. Fluorescenční mikroskop. Luminiscence (fluorescence, fosforescence) - fyzikální podstata jevu, Jablonskiho diagram, příklady. Bioluminiscence. Fluorescenční spektrum (fluorofory v roztoku, quantum dots). Konstrukce fluorescenčního mikroskopu (zdroj světla - Hg výbojka, filtry, polopropustná zrcadla, detektor - CCD kamera), vlastnosti zobrazení, výhody oproti zobrazení ve světlém poli.3. Konfokální mikroskop. Princip a konstrukce, historický exkurs, výhody a nevýhody oproti konvenčnímu mikroskopu. Skenovací mikroskop vs. spinning (Nipkow) disk. Speciální optické prvky: AOTF, AOBS, monochromátory, fotonásobič.4. Snímání mikroskopického obrazu - obraz jako kompromis. Digitalizace obrazové informace. Šum detektoru (rozdíl mezi CCD kamerou a fotonásobičem, efekt chlazení detektoru), photobleaching, rychlost snímání, šíře spektra snímaného signálu…poměr signál/šum jako kritérium kvality obrazu. Úprava kontrastu. Spektrální separace fluorescenčních signálů, numerické metody jejího vylepšení.5. Analýza mikroskopického obrazu. Kvantitativní měření intenzity fluorescence, morfologická měření, hodnocení vzájemné lokalizace dvou fluoroforů. 2D-scatterplot, kroskorelační funkce. 6. Biosensory, geneticky kódované fluorescenční značení proteinů. Mikroskopická měření koncentrací iontů, pH, membránového potenciálu. Tetracysteinové nekovalentní značky (FlAsH, ReAsH). GFP a další fluoreskující proteiny, speciální fluoreskující proteiny (GFP, timer, pHluorin). 7. Kinetická měření ve fluorescenčním mikroskopu. Snímání obrazu v čase, FRAP (FLIP, fotoaktivace, fotokonverze), FCS. Single particle tracking, mean square displacement.8. Detekce inter- a intramolekulárních interakcí pomocí fluorescence. FRET, FLIM - podstata jevu, způsoby měření, aplikace. Spektrálně rozlišený obraz, multidimenzionální mikroskopie.9. Restaurace obrazu - obrazová dekonvoluce. Mikroskopické zobrazení jako konvoluce, zobrazovací funkce mikroskopu (point spread function), principy inverzní transformace: přímá filtrace, iterační metody. PALM, korelativní mikroskopie. 10. Možnosti dalšího zvýšení prostorového rozlišení fluorescenčního mikroskopu. Nedokonalosti konfokálního zobrazení: limity rozlišení v laterálním a axiálním směru, absorpční hloubkový limit. Metody řešení: multifotonová mikroskopie, TIRF, SPIM, STED, strukturovaná iluminace.11. Zpracování mikroskopického obrazu. Lineární filtrace, eliminace šumu, morfologická analýza, Fourierova transformace - hranové a pásmové filtry, princip automatického ostření mikroskopu. 12. Úprava mikroskopického obrazu pro vědeckou publikaci. Vhodné, nevhodné a neomluvitelné způsoby zpracování mikroskopického obrazu.

Literatura

Sluder G and Wolf DE (Eds.) Digital microscopy, 3rd Edition. Methods in Cell Biology 81 (2007) ISBN 978-0-12-374025-0Sullivan KF (Ed.) Fluorescent proteins. Methods in Cell Biology 85 (2008) ISBN 978-0-12-372558-5Lakowicz JR. Principles of fluorescence spectroscopy, 3rd Edition. Springer (2006) ISBN 978-0387-31278-1.Webhttp://www.olympusmicro.comhttp://www.microscopyu.com http://micro.magnet.fsu.edu

Požadavky

Před vlastní zkouškou student vypracuje esej v rozsahu 500-1000 slov v jazyce českém, slovenském nebo anglickém na téma, které se 1) vztahuje k přednesenému učivu a 2) neshoduje s tématem eseje zvoleného dříve jiným studentem. Esejvypovídá o kvalitě přípravy na zkoušku. Nemá přímý vztah k otázkám kladeným při zkoušce, je však součástí hodnocení. Termín odevzdání eseje je nejpozději 2 týdny před termínem zkoušky.Zkouška probíhá ústní formou v jazyce, ve kterém byl sepsán esej. Během zkoušky by student měl prokázat porozumění základním pojmům probraného tématu v přibližném rozsahu:Mikroskopické zobrazení - Princip mikroskopického zobrazení; Zvětšení mikroskopu; Optické vady; Limity zobrazení mikroskopu (Airyho disk, Rayleighovo kritérium) Práce s mikroskopem - Köhlerovo osvětlení a jak ho nastavit; Druhy objektivů; ImerzeVybrané zobrazovací metody - Fázový kontrast; Diferenciální interferenční kontrastLuminiscence - Fluorescence, fosforescence (fyzikální podstata, Jablonskiho diagram); Bioluminiscence; Tvar fluorescenčního spektra - solvatace, polarita prostředí, teplotní závislostFluorescenční mikroskop - Vlastnosti zobrazení; Výhody fluorescenční mikroskopie oproti zobrazení ve světlém poliKonstrukce fluorescenčního mikroskopu - Zdroj světla (výbojky); Interferenční filtr; Detektor (CCD kamera); Zdroje šumu v obrazu z fluorescenčního mikroskopuPrincip a konstrukce konfokálního mikroskopu - Spinning-disk mikroskop; Laserový skenovací mikroskop;Výhody a nevýhody konfokálního oproti konvenčnímu zobrazeníSpeciální optické prvky - Laser; AOTF; AOBS; Monochromátory (hranolový, mřížkový); FotonásobičDigitalizace obrazu - Pixel, voxel, kódování intenzity a barev, dynamická hloubka; Vzorkování: Nyquistův teorémPoměr signál/šum - Zdroje šumu u CCD a PMT detekce, maximalizace SNR během snímáníSnímání obrazu: detekce nebo degradace? - Photobleaching; Maximální efektivní excitace, počet fluoroforů ve vzorku; Spektrální separace signálů: parazitní excitace, sekvenční snímání, linear unmixing Měření intenzity fluorescence - Vztah intenzity fluorescence ke koncentraci fluoroforu; Limitace srovnávacích měřeníMorfologická měření - Prahování; Zdroje artefaktůVzájemná lokalizace dvou signálů - Základní pojmy: kolokalizace, náhodný překryv, repulse; 2D-scatter plot (pixelogram); Korelace signálů - Pearsonův koeficient; Kroskorelační funkceBiosensory - Permeabilita membrány, koncentrace iontů, pH, membránový potenciálTetracysteinové nekovalentní značky (FlAsH, ReAsH)Fluoreskující proteiny - GFP a další barevné proteiny; Speciální proteiny: pHluorin, timeryZásady zobrazování živých buněkMěření redistribuce fluoroforu - Princip metody: FRAP, FLIP, fotoaktivace, fotokonverze; Speciální fluoreskující proteinyFCS (Fluorescence Correlation Spectroscopy) - Princip metody; Vyhodnocení dat: autokorelační funkce, srovnání s FRAPSingle particle tracking - Princip metody; Vyhodnocení dat: mean square displacementFCCS (Fluorescence Cross-Correlation Spectroscopy) - Princip metody, kroskorelační funkce; AplikaceFRET - Podstata jevu, pravděpodobnost FRET, aplikace; Metody měření (přímý FRET, vybělení akceptoru)Časově rozlišená fluorescence - Dohasínání a doba života fluorescence; Metody měření časově rozlišené fluorescence (TD-FLIM, FD-FLIM); TCSPC, FLIM-FRET; Anizotropie fluorescence, Homo-FRETBiFC - Princip metody, výhody a nevýhody; Mikroskopické zobrazení jako konvoluce; Konvoluce: definice a vlastnosti; Zobrazovací funkce mikroskopu - point spread function (PSF)Dekonvoluce - Zadání (zrestaurovat zpětně podobu pozorovaného objektu); Způsoby řešení: přímá inverze, iterativní metody; Slepá dekonvoluce; Měření PSF; Možné artefakty dekonvoluční analýzySTORM/FPALM/PALM - Princip metody; Limitace: příprava preparátu, doba snímání obrazuExcitace fluorescence v malé části vzorku - Multifotonová excitace, TIRF, SPIM; Princip, možnosti, omezení; Kombinace s PALM, STORM Strukturovaná iluminace - Princip SIM, SSIM, 3D-SIM; Tvar OTFSTED - Princip metody, CW-STED; Rozlišení; RESOLFTÚprava kontrastu - lineární a nelineární úpravy kontrastu, zachování obrazové informace; LUT; princip a způsoby použitíLineární filtrace - potlačení šumu, detekce lokálních extrémů a hran, zostření detailůFiltry využívající Fourierovy transformace - dolní propust, horní propust, pásmový FT filtrMorfologická analýza - základní morfologické operace (eroze, dilatace, otevření, uzavření) a jejich vlastnosti

Garant

doc. RNDr. Jan Malínský, Ph.D.

Vyučující

doc. RNDr. Jan Malínský, Ph.D.