Předmět Moderní imunofluorescenční techniky (CRH / MIT)

Na serveru studentino.cz naleznete nejrůznější studijní materiály: zápisky z přednášek nebo cvičení, vzorové testy, seminární práce, domácí úkoly a další z předmětu CRH / MIT - Moderní imunofluorescenční techniky, Přírodovědecká fakulta, Univerzita Palackého v Olomouci (UP).

Materiál	Typ	Datum	Počet stažení

Obsah

1. Historie vývoje a zavedení imunofluorescence do biologického výzkumu, teoretické základy a hlavní přednosti imunofluorescence. Porovnání s jinými metodami fluorescenční detekce.2. Základní koncepce užití imunofluorescence na pletivové a na buněčné úrovni, principy detekce epitopů v buňkách in situ a v izolovaných frakcích. Principy a způsoby detekce proteinů a jiných molekul.3. Základní metody detekce pomocí přímé a nepřímé imunofluorescence. Detekční systémy založené na principu specifických protilátek a biotin-streptavidin systému. Konjugace značek, selektivita a specificita. Detekce pomocí fluorochromů a porovnání s metodami využívajících konjugovaných enzymů, koloidních částic zlata a stříbra.4. Metody přípravy vzorků pro imunofluorescenci. Způsoby fixace fyzikálními, chemickými a kombinovanými metodami, zabezpečení dostupnosti epitopů pro protilátky. Imunofluorescenční mikroskopie celých rostlinných orgánů a řezaných vzorků.5. Praktická příprava rostlinných preparátů na imunofluorescenční detekci, provedení fixace, digesce buněčné stěny a permeabilizace plazmatické membrány.6. Imunologické základy využití protilátek v buněčné biologii, struktura, rozdělení, funkce a typy protilátek.7. Způsoby využití protilátek v imunofluorescenční mikroskopii. Primární a sekundární protilátky. Koncentrace protilátek, doba a podmínky inkubace, blokace nespecifické vazby. Fluorescenční vlastnosti konjugovaných fluorochromů, separace excitačních/emisních spekter, vícebarevná kolokalizace, pozitivní a negativní kontroly.8. Různé metody dobarvení buněčných struktur rostlinných vzorek po imunofluorescenčním značení k mikroskopické identifikaci. Metody přípravy trvalých preparátů uzavíráním vzorek do vhodného media, předcházení vypalování a uhasínání fluorescence při mikroskopickém snímání.9. Praktické imunoznačení připravených fixovaných rostlinných objektů pomocí předem určené primární a sekundární protilátky, konečná příprava preparátů k mikroskopování.10. Mikroskopování připravených preparátů na fluorescenčním mikroskopu a konfokálním laserovém skenovacím mikroskopu. Demonstrace specificity, stability a intenzity fluorescenčního značení.11. Konfokální mikroskopie s rotujícím diskem, vyhodnocování změn ve struktuře a pohyblivosti cytoskeletálních a endozomálních buněčných struktur12. Zhodnocení metodických přístupů a získaných dat formou prezentace interaktivních protokolů.

Získané způsobilosti

Studenti získají teoretické základy k pochopení přínosů imunofluorescence v buněčné biologii rostlin se schopností tyto vědomosti prakticky aplikovat

Literatura

Wymer CL, Beven AF, Boudonck K, Lloyd CW. Confocal microscopy of plant cells. Methods in Molecular Biology, vol. 122: Confocal Microscopy Methods and Protocols. Humana Press Inc., Totowa, NJ, 1999. Bacallao R, Sohrab S, Phillips C. Guiding principles of specimen preservation for confocal fluorescence microscopy. In: Handbook of Biological Confocal Microscopy, Third Edition. Springer Science+Business Media, LLC, New York, 2006. Haseloff J, Dormand E-L, Brand AH. Live imaging of green fluorescent protein. Methods in Molecular Biology, vol. 122: Confocal Microscopy Methods and Protocols . Humana Press Inc., Totowa, NJ, 1999.

Požadavky

Účast a vypracování protokolu z praktické části

Garant

Georgios Komis, Ph.D.doc. Mgr. Miroslav Ovečka, Ph.D.