Chromatografie

Chromatografie

• Separace látek

• Dvě fáze: stacionární a mobilní

• Rychlost průniku jednotlivých složek stacionární fází je různá – základ separace

Rozdělení podle mobilní fáze

• Plynová chromatografie (GC) – stacionární fáze je pevná nebo kapalná

• Kapalinová chromatografie (LC) – v biochemii nejčastěji, stacionární fáze je pevná nebo kapalná

Rozdělení KAPALINOVÉ chromatografie podle stacionární fáze

• Systém kapalina-kapalina (LLC)

  • Gelová permeační chromatografie

• Systém kapalina-pevná fáze (LSC)

  • Ionexová chromatografie

  • Afinitní chromatografie

Chromatograf se skládá ze zásobníku mobilní fáze, pumpy, kolony, detektoru, jímače frakcí. Vzorek dáváme mezi pumpu a kolonu přes nástřikový ventil. Grafu, který nám ukazuje průběh se říká chromatogram.

Základní pojmy:

• Retenční čas (tr) – doba od nástřiku vzorku na kolonu po okamžik, kdy daná látka opustí kolonu

• Eluční objem (Ve) – objem mobilní fáze od nástřiku na kolonu po okamžik, kdy daná látka opustí kolonu, lze ze znalosti průtoku přepočítat na retenční čas

• Mrtvý čas (tm) – doba, za kterou opustí kolonu nežádaná látka

• Mrtvý objem kolony (V0) – objem, za který opustí kolonu nežádaná látka, lze ze znalosti průtoku přepočítat na mrtvý čas

• Celkový objem náplně kolony/stacionární fáze (Vt)

Gelová permeační chromatografie

• Separace molekul na základě molekulové hmotnosti, velikosti a tvaru molekuly

• Stacionární fáze – kapalina ukotvená v gelu (prokřížený dextran, agarosa, polyakrylamid, překřížená agarosa)

  • Důležitá hodnota je velikost pórů gelu

  • Gel jsou v podstatě „kuličky s póry“

• Mobilní fáze – kapalina protékající mezi částicemi gelu/pufr

• Velké molekuli se eluují dříve, malé déle, protože se „zdrží“ než projdou všemi póry

• Použítí

  • Dělení látek

  • Stanovení molekulových hmotností

  • Odsolování

• Frakcionační rozsah – „velikost pórů“, rozsah molekulových hmotností, kterou mohou být odděleny touto metodou (větší molekuly projdou v mrtvém objemu jako první)

• Fibrilární proteiny jsou problémové – mohou se „zaseknout“ a zkreslit tak eluční objem

Ionexová chromatografie

• Separace na základě nábojových vlastností

• Stacionární fáze – ionex – nosič s navázanou funkční skupinou

  • Katex – záporný náboj – vazba kationtů

  • Anex – kladný náboj – váže anionty

• Mobilní fáze – pufr o pH vhodném pro separaci složek

• Afinita iontů k ionexu závisí na velikosti náboje, u proteinů hraje zásadní roli pH (závisí na něm jejich volný náboj)

• Příklad: stacionární fáze – anex, v koloně se zachytí anionty, v mrtvém obejmu vylezou jako první kationty a elektroneutrální látky, abych uvolnila anionty – změním pH – např přidám NaCl)

• Nízké pH – silná vazba na katex (proteiny jsou zde spíše kladně nabité)

• Vysoké pH – silná vazba na anex (proteiny jsou zde spíše záporně nabité)