Precipitační metody

• Existuje pět typů savčích imunoglobulinových těžkých řetězců (γ, ε, α, δ, µ) – podle nich pak dělíme protilátky

  • γ – IgG

  • ε – IgE

  • α – IgA

  • δ – IgD

  • µ – IgM

• Dělení protilátek podle přípravy

  • Monoklonální

    • Chemické individuum, všechny protilátky mají stejnou primární strukturu -> stejná afinita i specifita

    • Fungují jen proti jednomu epitopu daného antigenu

    • Čas přípravy – jeden až několik měsíců

    • Drahá příprava

    • Hybridomy (vznik spojením lymfocytů s rakovinovými buňkami?) lze zamrazit a skladovat několik let, jednotlivé várky se neliší jako u polyklonálních

    • Lymfocyty pochází ze sleziny

  • Polyklonální

    • Směs protilátek

    • Liší se afinitou i specifitou k jednotlivým epitopům daného antigenu

    • Problémem jsou různé reakce jednotlivců -> jednotlivé várky nejsou totožné

    • Čas přípravy – jeden až několik měsíců

    • Levná příprava

  • Rekombinantní

    • Izolace genů kódujících protilátky -> klonování -> exprese

    • Vyšší rychlost, kvalita, hustota vazebných míst

Imunokomplex – komplex antigenu a protilátky

Imunoprecipitace – sekundární jev při vzniku imunokomplexu

• Imunokomplexy in vitro? Vytvářejí nerozpustné, viditelné precipitáty (sraženiny) podobné mřížce

• Precipitát vzniká jen při určitém poměru Ag a Pl (1:1)

Imunochemické metody

Dělení:

• Imunoprecipitační – vhodné především pro polyklonální

  • V gelu – pzastaralé

  • V roztoku – turbidimetrie, nefelometrie

• Neprecipitační

  • bez značky – imunoafinitní chromatografie, imunosenzory

  • se značkou – ELISA, LFIA, FIA – fluorescenční imunoanaláza, CIA – chemilumuniscenční, RIA – radioimunoanalýza

Precipitační metody

• precipitační křivka – grafické znázornění imunoprecipitace

• osa x – množství/koncentrace antigenu

• osa y – množství precipitátu

• rozlišujeme tři oblasti grafu – (zleva) přebytek protilátky – zóna ekvivalence (zde vzniká precipitát) – přebytek antigenu

Imunoprecipitace v roztoku

• nevhodné pro hapteny – netvoří precipitát

• vhodnější jsou polyklonální protilátky (monoklonální tvoří precipitát pouze s antigenem obsahující více stejných epitopů reagujících s Pl)

• průběh sledujeme změnou optických vlastností roztoku

• kvantitativní stanovení

  • turbidimetrie – měří se procházející světlo (spektrofotometrem)

  • nefelometrie – měří se odražené světlo (nefelometrem)

Imunoprecipitace v gelu (imunodifúzní metody)

• difuze v gelu

• vznik precipitačních linií

• jednoduchá difuze

  • pouze pro porovnání množství jednotlivých antigenů

  • jeden z dvojice je kvantitativně zapolymerován do gelu, druhý difunduje

  • velikost vzniklého prstence je úměrná koncentraci antigenu

• elektroimunodifuze

  • difuze v elektrickém poli

  • vzniklé linie mají tvary raket

  • plocha vymezená precipitátem je úměrná koncentraci antigenu

Imunoaglutinace – nevím moc kam zařadit

• založeny na interakci nerozpustného antigenu a rozpustné protilátky za vzniku sraženiny – aglutinátu

• antigen obsahuje více stejných determinant -> vhodné i pro monoklonální Pl

• vhodné i pro hapteny (navázání na nerozpustný vodič)