Protokol - Biologie 10

jednotlivých fázích buněčného cyklu a analyzujte, jak velký podíl buněk se v každém vzorku
nachází v G1, S, G2 a v M fázi:

G1

S

G2

M

Permisivní teplota (24°C)

Počet buněk

Podíl buněk (%)

Restrikční teplota (37°C)

Počet buněk

Podíl buněk (%)

c) Podle morfologie buněk zjistěte, zda došlo k zástavě buněčného cyklu, případně ve které fázi.







Závěr:

ÚLOHA 2: ANALÝZA NORMÁLNÍHO BUNĚČNÉHO CYKLU A ZÁSTAVY BUNĚČNÉHO CYKLU

V LIDSKÝCH BUŇKÁCH POMOCÍ PRŮTOKOVÉ CYTOMETRIE

Princip stanovení obsahu DNA v buňkách průtokovou cytometrií:
Fixované buňky jsou označeny fluorescenčním barvivem, které se váže na DNA (obvykle propidium
jodid). V průtokovém cytometru je suspenze obarvených buněk vytlačována do velmi tenké kapiláry,
kterou buňky procházejí jedna za druhou. V této kapiláře jsou buňky ozařovány úzkým laserovým
paprskem a intenzita fluorescence (odpovídající obsahu DNA) každé jednotlivé buňky je
zaznamenávána. Výsledkem této analýzy je graf (tzv. histogram) znázorňující relativní počet buněk
s určitým množstvím DNA v analyzované suspenzi buněk.

Materiál: Kultura buněk nádorové linie HeLa, cytostatikum paklitaxel, roztok trypsin/EDTA, ethanol, propidium
jodid, průtokový cytometr, software pro vyhodnocení naměřených dat Floreada (www.floreada.io)

Provedení: Dvě paralelní kultury HeLa buněk byly kultivovány a) bez přítomnosti cytostatika (kontrola, normální
buněčný cyklus), b) v přítomnosti cytostatika paklitaxel (5µM, 12h). Poté byly kultury převedeny do
suspenze pomocí působení roztoku trypsinu/EDTA, a následně byly kultury fixovány ethanolem. Buňky
byly obarveny propidium jodidem a pomocí průtokového cytometru byl v jednotlivých buňkách
analyzován obsah DNA. Výsledky měření jsou k dispozici v podobě odkazu v interaktivní osnově
předmětu (soubor HeLa1 jsou výsledky měření kontrolního vzorku, soubor HeLa2 po působení
paklitaxelu). Soubory si otevřete v programu Floreada (dostupné v prohlížeči na www.floreada.io) a
analyzujte dle instrukcí v prezentaci.