Protokol - Biologie 10

Protokol č. 10

Metody analýzy buněčného cyklu

Biologický ústav LF MU

Podzim 2024

1

Protokol č. 10

METODY ANALÝZY BUNĚČNÉHO CYKLU

Buněčný cyklus eukaryotických buněk je sled dějů, začínající vznikem buňky dělením a končící jejím
rozdělením na dvě dceřiné buňky (případně může být přerušen smrtí buňky). V průběhu buněčného
cyklu eukaryotické buňky rostou, replikují svou DNA a dělí svou genetickou informaci i obsah cytoplazmy
mezi dvě vznikající dceřině buňky. Buněčný cyklus probíhá ve 4 základních fázích (G1, S, G2 a M) a
jeho délka je pro daný buněčný typ za daných podmínek konstantní. Každá zdravá lidská buňka
potřebuje k zahájení buněčného cyklu příslušné signály v podobě růstových faktorů a dostatek živin.
Samotný průběh buněčného cyklu pak trvá u lidských buněk přibližně 24 hodin (G1 fáze cca 11 hodin,
S fáze 8 hodin, G2 fáze 4 hodiny, M fáze 1 hodina. První tři fáze buněčného cyklu se souhrnně označují
jako interfáze. G1-fáze je přípravou na S-fázi – dochází během ní k růstu buňky a k syntéze enzymů,
potřebných pro replikaci. V S-fázi dochází k vlastní replikaci DNA. V G2-fázi se buňky připravují na
dělení. V následné M-fázi dochází k rozdělení genetického materiálu (dělení jádra mitózou) a poté
k rozdělení celé buňky (cytokineze). Podstatou mitózy, která probíhá u dělících se somatických buněk,je rovnoměrné rozdělení genetického materiálu do dvou geneticky identických dceřiných buněk.
Mnohá specifika buněčného cyklu byla odhalena pomocí jednoduchých a rychle se dělících
eukaryotických buněk, zejména kvasinek. Protože se dělí pučením, jednotlivé fáze buněčného cyklu
jsou u nich odlišitelné i morfologicky, podle velikosti vznikajícího pupene. Pro studium buněčného cyklu
lze tedy využít mikroskopické metody (světelná mikroskopie, fluorescenční mikroskopie, elektronová
mikroskopie).

Velikost pupene dělících se kvasinek Saccharomyces cerevisiae v jednotlivých fázích buněčného cyklu:

M-fáze

G1-fáze

G2-fáze

S-fáze

O tom, zda buňka vstoupí do dalšího buněčného cyklu a začne replikovat svou DNA, se rozhoduje v
G1-fázi, kde je hlavní kontrolní bod buněčného cyklu. Další kontrolní body jsou v G2-fázi (kontrola
poškození DNA) a v metafázi M-fáze (kontrola připojení všech chromozomů k dělícímu vřeténku).

Výzkum genetické regulace buněčného cyklu byl odstartován objevením kvasinkových mutant, tzv. cdc
(cell division cycle) mutant. Jsou to kmeny, mající termosenzitivní mutaci v různých genech důležitých
pro průchod buňky buněčným cyklem. V permisivní teplotě (24°C) se tedy kvasinky (v ideálním
případě) chovají jako normální nemutované buňky, avšak v restrikční teplotě (37°C) dojde vlivem tepla
k denaturaci teplotně-senzitivní formy některého proteinu, nutného pro průchod buněčným cyklem.
Analogy kvasinkových cdc genů se nacházejí i u člověka, mají však jiné názvy (například kvasinkový
cdc2 odpovídá lidskému cdk1).

Pro studium buněčného cyklu se může využít také sledování dynamiky růstu buněčných kultur (růstové
křivky). V pravidelných časových intervalech se vyhodnocuje počet buněk v dané kultuře a následně
se vyhodnotí rychlost dělení daného typu buněk v daných podmínkách. Touto metodou můžeme určit
délku buněčného cyklu – dobu potřebnou pro zdvojnásobení počtu buněk daného typu (tzv. doubling-