Protokol - Biologie 10

Protokol č. 10

Metody analýzy buněčného cyklu

Biologický ústav LF MU

Podzim 2024

2

time). U kvasinkových buněk, které mohou růst v kultuře s vysokou hustotou, je možné relativní
množství buněk v kultuře hodnotit měřením absorbance (optické hustoty) buněčných kultur. U lidských
buněk, které v kultuře nerostou v tak vysokých hustotách, jsou hodnoty absorbance kultur obvykle pod
detekčním limitem. Je tedy nutné zvolit jiné metody (např. počítání buněk v Bürkerově komůrce). U
nádorových buněk je často doubling-time vyhodnocován podle zvětšení objemu nádoru v těle pacienta
na dvojnásobek (zjištěné ultrazvukovým měřením nebo počítačovou tomografií – CT).

V současné době se však analýza buněčného cyklu provádí nejčastěji pomocí průtokové cytometrie,
techniky, umožňující měření fyzikálních a chemických charakteristik jednotlivých buněk. Vzorek
s buňkami je suspendován v pufru a nasáván ze zkumavky průtokovým cytometrem. Tenký proud
tekutiny unáší vzorek (ideálně po jednotlivých buňkách) do místa, kam je soustředěn paprsek laseru.
Při interakci s buňkami dochází k absorpci, fluorescenci a rozptylu světla. Parametry prošlého,
vyzářeného a rozptýleného světla jsou charakteristické pro různé buňky a jejich součásti. Lze tak rychle
prozkoumat desítky tisíc buněk a získaná data zpracovat počítačem.
Analýza buněčného cyklu pomocí průtokové cytometrie je založená na měření obsahu DNA
v jednotlivých buňkách. Protože množství DNA se v různých fázích buněčného cyklu liší, je možné na
základě množství DNA určit procentuální zastoupení buněk v různých fázích buněčného cyklu v
populaci studovaných buněk. Tato metoda také může odhalit zástavu buněčného dělení v určitém
kontrolním bodě buněčného cyklu. Proto je také využívána při testování protinádorových léčiv na
nádorových buněčných liniích, kdy se po aplikaci určitého léčiva sleduje, jestli, a v které fázi došlo
k zastavení buněčného dělení.

ÚLOHA 1:

ANALÝZA ZÁSTAVY BUNĚČNÉHO CYKLU KVASINKOVÝCH MUTANT CDC28 NA
ZÁKLADĚ MIKROSKOPICKÉHO POZOROVÁNÍ

Materiál: Kultura kvasinek Saccharomyces cerevisiae s termosenzitivní mutací v genu CDC28 (mutanty cdc28),
základní mikroskopické pomůcky