Protokol - Biologie 7

Protokol č. 7

Základní metody molekulární biologie I.

Biologický ústav LF MU

Podzim 2024

1

Protokol č. 7

ZÁKLADNÍ METODY MOLEKULÁRNÍ BIOLOGIE I.

Fyziologi a patologi lidských nemocí, vývoji nových léků a diagnostickým postupům nelze porozumět
bez nástrojů molekulární biologie a laboratorních technik. Objev struktury DNA odstartoval zcela novou
éru zkoumání nejen této základní molekuly dědičnosti, ale také podstaty dalších biomolekul, jako jsou
proteiny a RNA, s cílem odhalit vlastnosti živé buňky. Cílem tohoto cvičení je seznámení se se
základními metodami používanými v molekulární biologii, přičemž se zaměříme především na ty
techniky, které budou probírány a využívány během následujících týdnů i v dalším semestru.

Naprostou nezbytností při vyšetřovaní DNA je její izolace z buněk pacientů. V současnosti se DNA
izoluje pomocí komerčně dostupných kitů, které obsahují všechen chemický materiál potřebný pro
extrakci DNA. Buňky k izolaci DNA musí obsahovat jádro, proto při nejčastějším používaném odběru
z periferní krve musíme separovat frakci leukocytů. Za ne-invazivní způsob se považuje i stěr buněk
bukální sliznice. Ostatní způsoby lze považovat za invazivní a patří mezi ně třeba odběr plodové vody,
odběr choriových klků při prenatální diagnostice, dále buňky kostní dřeně nebo maligní buňky nádorů
získané biopsií.

Metody molekulární cytogenetiky zahrnují především FISH (fluorescent in situ hybridization), CGH
(comparative genomic hybridization) a metody hybridizačních chipů (DNA microarrays). Podstatou
těchto metod je hybridizace DNA - navázaní komplementárních, artificiálně připravených DNA sond na
vyšetřovanou DNA.

FISH umožňuje zviditelnit sekvence nukleových kyselin přímo na preparátech s chromozomy pacienta,
které jsou fixované na podložním skle (s přípravou karyotypu se víc obeznámíme na cvičení č. 8). Pro
vizualizaci celých chromozomů nebo konkrétních sekvencí se používají komplementární DNA sondy,
které jsou konjugovány s fluorescenčním barvivem. Za určitých podmínek tyto sondy hybridizují
s cílovou DNA a výsledný obraz je zachycen pomocí fluorescenčního mikroskopu. FISH se používají
k vizualizaci specifických lokusů i celých chromozomů a detekují tak nejen různé přestavby, ale i změny
v počtu chromozomů. Speciálně pro přestavby karyotypu se využívá spektrální karyotypizace, kde jsou
všechny páry chromozomů obarveny různými kombinacemi fluorochromů a ve výsledném zobrazení
má tedy každý chromozom jinou barvu.

Metoda CGH je využívána při vyšetřování změn v počtu kopií DNA sekvencí a umožňuje srovnávací
analýzu počtu jednotlivých sekvencí v celém genomu během jedné hybridizační reakce proti
kontrolnímu vzorku s normálními metafázními chromozomy. Pro označení testované i kontrolní DNA
jsou použity odlišné fluorochromy a výsledek (balancovaný materiál vs případná amplifikace nebo
delece části DNA) je vyhodnocen v závislosti na různé fluorescenci.