Protokol - Biologie 7
Níže je uveden pouze náhled materiálu. Kliknutím na tlačítko 'Stáhnout soubor' stáhnete kompletní formátovaný materiál ve formátu PDF.
ÚLOHA 1: CYTOGENETICKÉ VYŠETŘENÍ PACIENTA S PSYCHOMOTORICKOU RETARDACÍ
Materiál a metodika:
Vzorek DNA desetiletého pacienta s těžkou psychomotorickou retardací, autistickým chováním, ataxií
a epilepsií byl podroben celogenomové array-CGH. DNA pacienta (500 ng) a kontrolní DNA (lidská
mužská genomová DNA, 500 ng) byly štěpeny a označeny − DNA pacienta zeleným fluoroforem a
kontrolní DNA červeným fluoroforem. Oba vzorky byly poté smíchány, denaturovány, hybridizovány se
sondami na sklíčku (65 °C, 24 h, třepání), promyty, analyzovány na skeneru a vizualizovány pomocí
softwaru.
Výsledky:
a) Výsledek array-CGH vybraného úseku chromozomu 2. Každá tečka znázorňuje signál z jedné
sondy, barevné přerušované čáry představují prahové hodnoty pro delece a duplikace.
Popište, jakou strukturní chromozomovou aberací je pacient postižen a do kterých oblastí na
chromozomu 2 zasahuje. Kolik sond vykazuje odlišnou vazbu pacientovy a kontrolní DNA?
Protokol č. 7
Základní metody molekulární biologie I.
Biologický ústav LF MU
Podzim 2024
3
Za účelem potvrzení změn počtu kopií zjištěných pomocí a-CGH byla provedena kontrolní FISH.
Metafázní chromozomy byly získány z kultur lymfocytů periferní krve. Pro každou analýzu bylo
vyšetřeno 10 metafází a 25 interfázních jader.
b) DNA byla nespecificky obarvena DAPI (modře), sonda RP11-659J19 (značená zeleně)
detekuje 2q23.1, sonda 2qter (značená červeně) detekuje terminální část chromozomu 2 a
slouží jako kontrola. Odhadněte, zda je pacient heterozygot nebo homozygot pro zjištěnou
strukturní aberaci.
Protokol č. 7
Základní metody molekulární biologie I.
Biologický ústav LF MU
Podzim 2024
4
c) Srovnání FISH provedené u pacienta (a), jeho matky (b) a jeho otce (c). DNA byla obarvena
nespecificky pomocí DAPI (modře), bílá šipka označuje kontrolní centromerickou sondu
(zelená). Sonda RP11-107E5 (červená) detekuje 2q22.3, sonda RP11-72H23 (zelená) detekuje
sekvenci na hranici mezi 2q22.3 a 2q23.1. Odhadněte, zda rodiče pacienta nesli danou
strukturní aberaci.
ÚLOHA 2: ANALÝZA KREVNÍHO OBRAZU POMOCÍ PRŮTOKOVÉ CYTOMETRIE
Princip analýzy krevního obrazu průtokovou cytometrií:
Zastoupení jednotlivých krevních buněk (vyjma erytrocytů) je zjištěno jednak pomocí velikosti a vnitřní
struktury (granularity) buněk, a dále pomocí tzv. diferenciačních znaků (CD) na povrchu buňky.
Například antigen CD45 je přítomen na všech lidských leukocytech, antigen CD3 pouze na T-
lymfocytech, CD19 pouze na B-lymfocytech atd. Značení jednotlivých CD pomocí protilátek a následná
analýza na průtokovém cytometru nám tak umožní jednotlivé subpopulace rozlišit.
Materiál: Vzorek lidské krve v EDTA (protisrážlivé činidlo), monoklonální protilátky proti specifickým CD markerům
leukocytů, průtokový cytometr.
Provedení: Žilní krev byla odebrána do zkumavky s EDTA, aby se předešlo jejímu srážení. Červené krvinky byly
lyzovány, leukocyty byly inkubovány po dobu 30 min v roztoku fluorescenčně značených
monoklonálních protilátek a následně analyzovány průtokovým cytometrem.
Výsledky měření jsou k dispozici v podobě odkazu v interaktivní osnově předmětu (soubor Krev_FC).
Soubor si otevřete v programu Floreada (dostupné v prohlížeči na www.floreada.io) a analyzujte dle
instrukcí v prezentaci.