Protokol - Biologie 7

Mnohem citlivější metodou je array-CGH, ve které jsou metafázní chromozomy nahrazeny přesně
definovanými sekvencemi ssDNA imobilizovanými ve více kopiích v jednom místě (tzv. spot) na pevném
podkladu (tzv. chip). Počet takovýchto různých sekvencí (spotů) může dosahovat až jednoho milionu.
Výsledek hybridizace je odečítán pomocí speciálních skenerů.

Průtoková cytometrie umožňuje měření fyzikálních a chemických charakteristik jednotlivých buněk.
Vzorek s buňkami je suspendován v pufru a nasáván ze zkumavky průtokovým cytometrem. Tenký
proud tekutiny unáší vzorek (ideálně po jednotlivých buňkách) do místa, kam je soustředěn paprsek
laseru. Při interakci s buňkami dochází k absorpci, fluorescenci a rozptylu světla. Parametry prošlého,
vyzářeného a rozptýleného světla jsou charakteristické pro různé buňky a jejich součásti. Lze tak rychle
prozkoumat desítky tisíc buněk a získaná data zpracovat počítačem. Průtoková cytometrie má široké

Protokol č. 7

Základní metody molekulární biologie I.

Biologický ústav LF MU

Podzim 2024

2

využití v biomedicínském výzkumu, ale i v medicínské praxi, především v hematologi a imunologii. V
klinické diagnostice se používá například k analýze krevního obrazu.

Krevní obraz je celkové vyšetření krve, které zjišťuje poměry jejích jednotlivých složek vyjma plazmy (ta
se vyšetřuje v rámci hematokritu a při sérologickém vyšetření). Pomocí průtokové cytometrie
stanovujeme zastoupení jednotlivých populací leukocytů, tj. percentuální zastoupení B- a T-lymfocytů,
monocytů, neutrofilních, bazofilních a eosinofilních granulocytů. Vyšší nebo nižší poměry jednotlivých
frakcí lišící se od fyziologické situace zdravého člověka mohou indikovat patologický stav (např.
leukémie). Jednotlivé subpopulace leukocytů zjišťujeme na základě přítomnosti typických markerů,
které se nacházejí na membráně jednotlivých buněk.

V medicínské i výzkumné praxi se často používají monoklonální protilátky. Vyrábějí se dvěma způsoby:
pomocí hybridomů a klonováním. V prvním případě se laboratorní zvíře imunizuje antigenem, proti
němuž chceme vytvořit protilátku. Po několika týdnech je ze zvířete vyjmuta slezina a z ní se izolují
plazmatické buňky. Ty se pak in vitro fúzují s buňkami myelomu, čímž získáme unikátní typ buněk:
produkující protilátky a zároveň nesmrtelné. Po následné selekci buněk produkujících požadovaný typ
protilátky, se tyto buňky klonálně namnoží.

Výroba monoklonálních protilátek metodou rekombinantní DNA (klonováním) je složitější a vyžaduje
integraci sekvence DNA kódující protilátku do vektoru a jeho následné vložení do buněk, které budou
tento gen exprimovat. Pro produkci protilátek využíváme výhradně savčí buňky.

Využití protilátek je široké: vizualizace proteinů a buněčných struktur ve výzkumu i medicíně, rozlišovaní
vývojových stádií buněk, studiumproliferace, apoptózy a dalších buněnčých procesů, případně detekce
malignit u nádorových buněk.