60. DNA diagnostika, zdroje nepřesnosti nepřímé DNA diagnostiky

58 DNA DIAGNOSTIKA, ZDROJE NEPŘESNOSTI V NEPŘÍMÉ DNA DIAGNOSTICE

= Molekulárně genetické vyšetření

Cíl: potvrdit diagnózu choroby podmíněné genovou mutací nebo zjistit genetické dispozice k onemocnění v rodinách s určením rizika postižení u potomků

Přímá DNA diagnostika:

• detekuje zda analyzovaná DNA nese či nenese mutaci

• použití genových sond pro určení mutované alely v genomu

• upřednostňována, avšak ne vždy je umožněna – nedostatek znalostí o daném genu a metodická náročnost v laboratorní praxi

• Metoda PCR (polymerázová řetězová rekce): rychlá analýza konkrétního genu,

Postup: In vitro, Známe sekvenci analyzovaného genu, podle níž vytvoříme specifické oligonukleotidové sekvence, tzv. primery. Ty se poté budou vázat na komplementární DNA sekvenci a ohraničovat požadovanou cílovou oblast v genomické DNA. Přítomnost tepelně stabilní DNA polymerázy a DNA prekurzorů (čtyř deoxynukleosidtrifosfátů) zahájí syntézu nového řetězce DNA. Nově syntetyzované řetězce DNA slouží jako templát pro syntézu DNA – vzniká pak více kopií specifické cílové sekvence, což umožňuje vizualizaci a další analýzu studovaného genu.

• Metoda přímé detekce již známých mutací: odhalí přítomnost/ nepřítomnost specifické mutace v DNA

• Metody přímého vyhledávání neznámých mutací: odhalí odchylky v sekvenci DNA pacienta - vždy jen ve srovnání se standardní sekvencí

→ Přímá DNA diagnostika:

- u autosomálně recesivních (AR) chorob - cystické fibrózy určí genotyp u postižených jedinců

- u homozygotů: mutace na obou alelách jsou stejné

- u smíšených heterozygotů: mutace na alelách genu jsou rozdílné

- vyhledá nositele patologické alely

Nepřímá DNA diagnostika

• založena na vazebné analýze, identifikuje fragment DNA ve které se poškozený gen nachází

• pracuje s polymorfismy (varianta DNA bez fenotypového účinku, 1:100)

• potřebujeme DNA od jednotlivých členů rodiny a potřebujeme rodokmen

• využívána u chorob které nelze diagnostikovat přímou diagnostikou z důvodu:

• velikosti genu (gen pro dystrofin, gen pro neurofibromin)

• existence homologních pseudogenů

• rozptýlení mutace v celé délce genu

• v případech, kdy patologický gen nebyl doposud klonován

• Postup: chromosomová DNA je rozštípána na fragmenty restrikční endonukleázou, fragmenty jsou roztříděny elektroforézou v gelu podle velikosti, přeneseny na membránu a hybridizovány se sondou, která detekuje konkrétní fragment obsahující konkrétní gen

Vazebnou analýzu lze:

• v rodinách s dvěma a více jedinci s klinicky potvrzenou diagnózou

• v případě rozlišení dvou chromozomů pomocí markerů na DNA

• přiřazením DNA markerů (tj. chromozomu) k patologii v rodině

Vazebné markery:

• polymorfní sekvence DNA – po celém genomu

• umožní sledovat segregaci alel studovaného genu

• využité je pouze rodinně specifické a nepotvrdí klinickou diagnozu