Neprecipitační metody

Neprecipitační metody – se značkou

ELISA (Enzymová imunoanalýza na pevné fázi)

• detekci umožňuje enzymová reakce -> změna barvy substrátu (výsledná křivka má tvar sigmoidy)

• Kompetitivní – (vhodná i pro hapteny), křivka je KLESAJÍCÍ

  • přímá

    • Pl je zakotvena na pevné fázi – interaguje s Ag ve vzorku (který chceme stanovit) a s Ag, který je označen enzymem

    • Značený a neznačený Ag tedy soutěží o omezené množství vazebných míst na Pl

    • Ustanovení rovnováhy –> promytí nezachycených Ag -> změření aktivity enzymu (změna barvy)

    • Čím více vzorek obsahuje (neoznačeného, stanovovaného) Ag, tím menší měřená enzymová aktivita

    • Vhodné i pro hapteny

  • nepřímá

    • Ag zakotvený na pevný nosič soutěží se stanovovaným Ag ve vzorku o omezený počet vazebných míst na Pl (které jsou přidávány do roztoku)

    • Čím více Ag v analyzovaném vzorku, tím méně Pl se naváže na zakotvený Ag, tím tedy i menší odezva

      • (volný Ag zachytí většinu protilátek a vymyje se pryč)

    • Po ustanovení rovnováhy a promytí se zjišťuje množství zakotvené protilátky – pomocí enzymem značené sekundární protilátky (která se na primární protilátku naváže)

    • vhodné i pro hapteny

    • výhoda oproti přímé metodě – univerzálnost použití značené protilátky, stanovení jakéhokoliv analytu

• Nekompetitivní (sendvičová) – křivka ROUSTOUCÍ (pracuje se s přebytkem imunoreaktantů), nelze požít pro hapteny!

  • přímá

    • Pl je zakotvena na pevnou fázi – interaguje se stanovovaným Ag

    • Ustanovení rovnováhy – promytí – přidání enzymem značené Pl, která se naváže na Ag „z druhé strany“ (sendvič)

    • Další promytí – měření enzymové aktivity -> odezva je úměrná koncentraci stanovovaného Ag

    • Lze použít pouze pro Ag s dvěma a více epitopy! (-> ne pro hapteny)

LFIA – imunochromatografické testy (např. testy na covid)

• Značka – částice uhlíku, zlata, křemíku

• Jeden z imunoreaktantů je navázán na značku, druhý je vázán na membráně

• Kombinace chromatografie + vzniku imunokomplexu

• Výsledek je rozlišitelný okem, jednoduché a rychlé provedení

• Test se skládá z podložky pro vzorek, nitrocelulózové membrány, testovací linky, kontrolní linky, absorpční podložky a výztuže

• Uspořádání může být otevřené (testovací proužek) nebo uzavřené (krabička)

  • Nekompetitivní/sendvičové uspořádání – vhodné ke stanovení Ag s více epitopy

    • Konjugát protilátky s barevnou částicí se naváže na Ag (pokud je přítomný) – díky němu vidíme barevnou odezvu na linkách

    • Na testovací lince jsou obsaženy protilátky reagující se stanovovaným Ag – linka se zabarví pokud je antigen přítomný

    • Na kontrolní lince jsou obsaženy sekundární protilátky, které reagují s konjugátem protilátky s barevnou částicí – měla by se zbarvit vždy (jinak je test neplatný)

    • Pozitivní test = dvě čárky

  • Kompetitivní uspořádání

    • Na testovací lince je analog analytu/Ag vázaný na inertní protein