Protokol - Biologie 8
Níže je uveden pouze náhled materiálu. Kliknutím na tlačítko 'Stáhnout soubor' stáhnete kompletní formátovaný materiál ve formátu PDF.
Protokol č. 8
Lidský karyotyp a chromozomální aberace
Biologický ústav LF MU
Podzim 2024
1
Protokol č. 8
LIDSKÝ KARYOTYP A CHROMOZOMÁLNÍ ABERACE
Karyotyp je uspořádaný soubor všech chromozomů eukaryotické buňky, který zaznamenává jak počet
chromozomů každého chromozomového páru, tak jejich strukturu. Aby bylo možné chromozomy
pozorovat a analyzovat, je potřeba použít buňky s DNA kondenzovanou do chromozomů viditelných
pod mikroskopem – to znamená dělící se buňky, které právě procházejí mitózou. Základním
materiálem pro sestavení karyotypu pacienta jsou obvykle lymfocyty periferní krve. Buňky z odebrané
krve pacienta se kultivují po dobu 2-3 dnů s přídavkem fytohemaglutininu, který u lymfocytů indukuje
buněčné dělení. Protože potřebujeme buňky zastavit v mitóze (v metafázi, kdy jsou chromozomy nejvíce
kondenzované, a tedy i nejlépe viditelné), přidává se k buňkám kolchicin – mitotický jed, který
zabraňuje polymerizaci mikrotubulů dělícího vřeténka a vede tak k zastavení mitózy po kondenzaci DNA
(v takzvané C-metafázi). Pak se buňky vystavují působení hypotonického roztoku, což způsobí
zvětšení buněk, vylití cytoplazmy a tím i oddělení jednotlivých chromozomů pro jejich lepší
pozorovatelnost. Následně jsou buňky fixovány a barveny pruhovací technikou (nejčastěji Giemsovým
barvením). Takto připravený vzorek je pozorován v mikroskopu a fotografován, nebo vyhodnocen
softwarově.
Karyotyp se dá sestavit také za použití jiných buněk izolovaných z těla pacienta, například z buněk
nádorové tkáně, kostní dřeně, kožních fibroblastů, nebo v případě prenatální diagnostiky z amniocytů
(buněk plodu v plodové vodě) nebo z buněk choriových klků.
Lidské chromozomy se podle mezinárodně používané Denverské klasifikace dělí do sedmi tříd podle
velikosti a pozice centromery. Jednotlivé chromozomové páry se pak rozpoznávají podle pruhovacího
vzoru získaného barvením jednou z pruhovacích technik.
Nejčastěji používané pruhovací techniky: - G (Giemsa) – chromozomy jsou vystaveny působení trypsinu, který denaturuje proteiny obsažené
v DNA; Giemsovo barvivo se pak váže s vyšší intenzitou na oblasti DNA bohaté na AT páry nukleotidů,
což vede k vzniku světlých a tmavých pruhů na chromozomech – pruhovacího vzoru
- Q (Quinacrine) – touto technikou vznikají pruhy podobné G pruhovací technice, pro pozorování
chromozomů je ale potřeba fluorescenční mikroskopie
- R (Reverse) – chromozomy se před barvením Giemsovým barvivem vystaví zvýšené teplotě, což
způsobí opačné zbarvení pruhů oproti konvenční G pruhovací metodě
- C (Centromeric heterochromatin) – před použitím Giemsova barviva jsou chromozomy vystaveny
nízkému a vysokému pH; touto technikou se intenzivněji barví oblasti obsahující vysoce repetitivní
sekvence DNA