Obecná enzymologie

Makroenzymy

• Enzym navázán na plazmatickou bílkovinu (nejčastěji na IgA nebo IgG)

• Častěji u pacientů s autoimunitními nemocemi, ale i bez zjevné příčiny

• Neprojde do moči (koncentrace v krvi stoupá, v moči je nulová nebo nízká)

• Příkladem je makroamyláza, při které má pacient v krvi vysokou aktivitu AMS a nemá žádné klinické příznaky onemocnění slinivky břišní ani slinných žláz. Pokud bychom neuvažovali o možnosti makroamylazemie mohl by být pacient poškozen zbytečným vyšetřováním případně dietními omezeními.

• Vznik makromolekul enzymů se může týkat kteréhokoliv enzymu

• Stanovení: elektroforéza, imunochemie, chromatografie

Průběh reakce E - S

Závisí na:

• Reakční teplotě (37°C = teplotní optimum)

(25°C - reakce běží nejlineárněji, ale pomaleji)

• Při stoupající teplotě běží reakce rychleji, ale při překročení teplotního optima rychlost zase klesá z důvodu denaturace bílkovinné části E)

• pH substrátu - pH optimum = pH, při kterém reakce probíhá nejrychleji; pH krve - 7,36 - 7,44

  • Výjimky: Pepsin - pH 1-2

  • ALP - pH 8

• Koncentrace substrátu - pokud je dostatečně vysoká, probíhá reakce podle kinetiky nultého řádu; závislost rychlosti reakce ( a přírůstku koncentrace produktu) na čase je lineární

  • Při nízké koncentraci substrátu je malá pravděpodobnost, že se molekule substrátu setká s E, rychlost reakce se snižuje, reakce běží podle kinetiky prvního řádu (tvar paraboly)

  • Při nadbytku substrátu a 100% nasycení enzymů má závislost reakční rychlosti na koncentraci substrátu (tvar hyperboly)

• Michaelisova konstanta - výpočet, jehož hodnota vypovídá o afinitě E k S. Čím je hodnota Km nižší, tím je afinita E k S vyšší

• Přítomnost aktivátorů

  • Urychlují E reakci - kationty lehkých kovů, vitaminy

• Přítomnost inhibitorů

  • Zpomalují nebo zastavují E reakci - kationty těžkých kovů, metabolity léků

  • Inhibitory:

    • Kompetitivní - mají strukturu molekuly podobnou substrátu, enzym si obě molekuly "splete", reakce E - S nemůže proběhnout

    • Nekompetitivní - molekula inhibitoru je odlišná od struktury substrátu, vazba může vzniknout mimo aktivní centrum a rychlost reakce se obvykle jen zpomalí

    • Inhibice může být vratná (reverzibilní) nebo nevratná (ireverzibilní)

Stanovení enzymů

• Spektrofotometricky - stanovení katalytické aktivity E

  • K analyzovanému vzorku se přidá substrát, který se působením enzymu mění na barevný produkt, hodnotí se intenzita zabarvení:

    • Po zastavení reakce - v koncovém bodě "end point"; diskontinuální postup, možnost chyby při nelineárním průběhu reakce

    • Kontinuální, kinetický způsob - absorbance se měří opakovaně v pravidelných intervalech v průběhu celé reakce, vybere se nejlineárnější část

  • Při fotometrickém stanovení se využívá tzv. optický test: je založen na změnách elektronové konfigurace jádra koenzymů NADH a NAD+ při reakci enzymu a substrátu. Využívá odlišné chování koenzymů při různých vlnových délkách (260 a 340nm) výsledná absorbance se měří v UV oblasti (340nm)