59. Mikrosatelity a jejich využití v genetickém mapování člověka a DNA diagnostice

Mikrosatelity (též SSR—Simple Sequence Repeat)

= sekvence DNA složené z opakujících se jednotek (2-6 nukleotidů) – délka až 100 bazí

• vysoká frekvence mutací – genetická proměnlivost

- proto jsou pro jedince vysoce specifické a lze je využívat k určování otcovství atd.

• vyskytují se ve všech oblastech genomu, nejvíce v nekódujících oblastech

• Využívají se jako genetické markery (= snadno rozpoznatelné úseky DNA, který se sleduje na předem daném místě)

• Využívají se při studiu příbuzenských vztahů, určování paternity, tvorba genetických map, v genetice populací

• tandemově se opakující úseky DNA nejčastěji o délce 2-6 párů bazí

• zkratky STRs (short tandem repeats), SSR (simple sequence repeats), nebo VNTRs (variable number of tandem repeats)

• biologická funkce je stále nejasná

• díky vysoké mutační rychlosti jsou mikrosatelity velmi polymorfní (to znamená, že se nacházejí v různých variantách v rámci jedné populace)

• detekce pomocí PCR metody použitím dvou oligonuklotidových primerů, které ohraničují mikrosatelitový lokus

• děděny kodominantně (mendelisicky)

• využití:

  • uplatnění nacházejí především při studiu příbuzenských vztahů, určování paternity, nebo při studiu parametrů populačně-genetické struktury, jako je tok genů a jeho bariéry, efektivní velikost populace nebo odchylky od Hardy Wienbergovy rovnováhy

• struktura:

  • dinukleotidové (CACACACA)

  • trinukleotidové (ATGATGATGATG)

  • případně tetranukleotidové (CATGCATGCATGCATG)

  • většinu mikrosatelitů v genomu (30-60%) tvoří pravděpodobně dinukleotidové repetice

  • v genomu obratlovců nejčastěji: (AC)n (AT)n (AAT)n (CAG)n (GATA)n a (GACA)n

  • dokonalé - nepřerušené CACACACA

  • nedokonalé/neúplné - CTCTCTCTGTCTCTCT

  • složené - CACACACATGTGTGTG

  • přerušované CACACATTCACACATTCACACA

  • u prokaryot i eukaryot

  • nejvíce v nekódujících oblastech (telomery, subtelomery, heterochromatin u centromer)

  • v kódujích oblastech u obratlovců pouze 9 - 15 % mikrosatelitů

• mutační mechanizmy

  • a) posun DNA při její replikaci

Posun během replikace může nastat, když se vznikající vlákno DNA uvolňuje z templátu. Dvojitá šroubovice DNA ještě není extrémně stabilní a podléhá významným termálním fluktuacím, může takto dojít k tzv. "slip-strand mispairing errors". Pokud právě DNA polymeráza replikuje oblast mikrosatelitové repetice, DNA řetězce po denaturaci nemusí přesně přisednout, ale dosednou na komplementární řetězec s posunem o jednu nebo několik jednotek repetice. Nově vzniklé vlákno bude pak buď delší nebo kratší než vlákno templátu .

• b) rekombinace mezi molekulamy DNA

Rekombinace mění délku mikrosatelitů dvěma způsoby, buď nerovnoměrným crossing-overem nebo genovou konverzí. Nerovnoměrným crossing-overem se myslí crossing-over mezi chromozomovými vlákny (molekuly DNA), které jsou nepřesně spárovány, např. sesterské chromatidy, nebo homologní chromozomy při meiotickém dělení. Stává se to především u dlouhých, tandemově se opakujících sekvencí, kde má rekombinační mechanismus problém určit správné místo zápisu mezi dvěma vlákny. Takto dochází k delecím na jednom vlákně a inzercím na vlákně druhém. Genová konverze se vztahuje k přenosu DNA sekvence mezi dvěma nesesterskými chromatidami během rekombinace. Na začátku máme dvě molekuly DNA, z nichž jednu můžeme nazvat jako donorovou a druhou jako akceptorovou. Ke genové konverzi dojde tak, že donorová molekula předá část svého řetězce molekule akceptorové. Na rozdíl od crossing-overu se změny odehrávají pouze na jednom vlákně akceptorové molekuly.