1. ZT - stanovení koncentrace bílkovin

Biochemie – 1. zápočtový test – stanovení koncentrace bílkovin

• Stanovení je založeno na vytvoření kalibrační křivky z měřený připravených standardů o známých vlastnostech a následného odečtení koncentrace bílkovin v neznámém vzorku z dané kalibrační křivky

• Koncentraci vynášíme na osu x, druhou veličinu na osu y (závisí na vybrané metodě)

Spektrofotometrie

• Založeno na měření rozdílu celkového záření zdroje a záření prošlého kyvetou se vzorkem stanovovaného roztoku do detektoru

• 2 možnosti – podle vybrané veličiny

  • Měříme TRANSMITANCI (kolik záření prošlo vzorkem z počátečního záření)

  • Měříme ABSORBANCI (kolik z počátečního záření bylo vzorkem pohlceno/absorbováno)

• I/I0 = T

• log I0/I = A

• Lambertův-Beerův zákon:

  • A λ = ε . c . l

  • l – délka kyvety

  • c – koncentrace

  • ε – molární absorpční koeficient (pro každou látku jiný)

  • A λ – absorbance při dané vlnové délce

  • Absorbance je přímo úměrná koncentraci stanovovaného analytu

  • A může nabývat 0 až nekonečno – pro měření potřebuji 0 < A < 1-2

Spektrofotometrie se využívá i při obecném stanovování proteinů/peptidů v roztoku – aromatické postranní řetězce tyrosinu a tryptofanu (částečně i fenylalaninu) absorbují ultrafialové záření s maximem kolem 280 nm - můžeme je tak od nukleových kyselin které absorbují okolo 260 nm. V oblasti 200 až 220 nm absorbuje peptidová vazba (v této oblasti ale absorbuje kdeco, proto se jí jako důkaz příliš nevyužívá)

Nepřímé stanovení proteinů pomocí činidel

• Měříme závislost absorbance na koncentraci absorbující látky

• Biuretová metoda

  • Interakce proteinů s ionty mědi

  • Chelatace Cu2+ peptidovou vazbou v ALKALICKÉM prostředí – vzniká modro-fialový komplex

  • Název podle biuretu – NH2CONHCONH2

  • Problém s glukosou, amonnými solemi, fosfáty, látky redukující měď – DTT, fenoly, merkaptoethanol) – také reagují

• Hartree-Lowryho metoda

  • Rozšíření biuretové metody

  • Biuretové činidlo + složku redukovanou fenoly – modré zbarvení

  • Problém s kyselými látkami a látkami redukující měď

• Bicinchoninová metoda

  • ALKALICKÁ redukce Cu2+ + chelatace kyselinou bicinchoninovou – vznik červeného komplexu

  • Problém s redukující sacharidy, amonné soli, látky redukující měď

• Metoda podle Bradforda

  • Vazba Coomassie Brilliant blue v KYSELÉM prostředí – modré zbarvení

  • Vhodné pro glubulární bílkoviny (hydrofobní interakce)

  • Závisí na obsahu bazických a aromatický AMK

  • Problém s mnoha látkami

Ninhydrinová metoda

• Vazba ninhydrinu na AMK v proteinu – na N-konec a Lys

• Vhodné pro stanovení krátkých peptidů či jen AMK nebo nejprve protein nechat totálně zhydrolyzovat

• Vzniká modrofialový produkt, kromě Pro ten dává žluté zbarvení

• Standard – Leu

Přímé stanovení proteinů ze sušiny

• Sušení dokonce konstantní hmotnosti

• nutná odstranit ostatní netěkavé látky

• kalibrace není nutná