Fluorofory v biomedicíně

zprůměrováním r(t) přes čas a intenzitu

(2.13) r0/r = 1 + τ/τr = 1 + 6Drτ = 1 + kTτ/Vη = 1 + C(r)Tτ/η

kde je C(r) – parametr rotující molekuly, který je slabě závislý na r a pro nesférické molekuly

se musí experimentálně určit. Měřené hodnoty anizotropie ustálené fluorescence r tedy mohou

sloužit ke sledování kvalitativních změn fluidity nejbližšího okolí (kolem 10 nm) fluoreskující

molekuly. Vyšší hodnota anizotropie znamená nižší fluiditu a naopak. Závislost r na η je však

nelineární a pouze kolem hodnoty r0/2 lze dostatečně přesně detekovat změny η. Ve většině

případů jsou změny C(r) a τ v závislosti na r malé a působí proti sobě. Perrinův vztah (2.13)

potom lze při konstantní teplotě zjednodušit

(2.14) ((r0/r)-1))-1 = K.η

kde K je konstanta. Pro sledování relativních změn mikroviskozity tedy není nezbytné měření

dob dohasínání fluorescence, které vyžaduje složitější aparaturu.

Stanovení změn fluidity buněčných membrán na základě měření anizotropie ustálené

fluorescence vhodné sondy je pro svou jednoduchost velmi rozšířeno. Problém spočívá v tom,

že Perrinův vztah byl odvozen pro sondu v izotropním prostředí, což lipidová dvojvrstva

buněčných membrán v žádném případě není. Pojem fluidity či mikroviskozity buněčných

membrán potom ztrácí fyzikální význam a v těchto měřeních se jedná pouze o

kvalitativní postižení změn uspořádání mikrookolí sondy a její pohyblivosti v

membráně. Pomocí časově rozlišené fluorescence bylo potvrzeno, že anizotropie

fluorescence určená stacionární metodou v sobě obsahuje jak informaci o pohyblivosti

membránových molekul, tak informaci o jejich průměrném uspořádání. Kvantitativní

zastoupení těchto dvou informací nelze z měření ustálené fluorescence určit.

Parametry pro popis dynamických vlastností membrán, jako anizotropních systémů

Vztahy uvedené výše platí pouze pro izotropní prostředí a sférickou molekulu sondy.

V druhém přiblížení bereme biologické membrány jako částečně anizotropní – tj. pohyb

v membráně je omezený a rozlišujeme pohyb v rovině lipidové dvojvrstvy a kolmo k ní.

Anizotropie fluorescence r(t) v tomto kapalně-krystalickém prostředí nedohasíná k nule, jako

je tomu u izotropní tekutiny (viz vztah 2.10), ale k určité limitní hodnotě r(∞)

(2.15) r(t) = r(∞) + (r(0)- r(∞)) exp(-t/τr)

Hodnota r(∞) je vztahována k průměrné orientaci podélné osy molekuly sondy vzhledem

k určitému směru (kolmici k rovině membrány). Pro interpretaci r(∞) tyčinkovité molekuly

membránové sondy 1,6-difenyl-1,3,5-hexatrienu (DPH) byl vytvořen tzv. model kolísání

v kuželu a byly zavedeny parametry orientačního pořádku. Pro r(0) i r(∞) byly odvozeny

obecné vztahy, zde neuváděné. Zatímco počáteční hodnota r(0) je závislá pouze na úhlu mezi

absorpčním a emisním pásem (viz vztahy 1.13, 1.14), limitní hodnota pro dlouhé časy r(∞)