Fluorofory v biomedicíně

Tabulka 2.12 Vybrané fluorescenční indikátory Ca2+

λF – vlnová délka pro volnou formu sondy, λB – vlnová délky pro vázanou formu sondy; Ex – značí měření při

uvedené vlnové délce excitace, Em – značí měření při uvedené vlnové délce emise, dvojice čísel oddělená

lomítkem značí poměrné měření při dvou různých vlnových délkách

(Podle: 1. Handbook of Fluorescent Probes and Research Products; 2. Lakowicz 1999.)

2.3.6. Indikátory pH

Fluorescenční sondy citlivé na pH umožňují měření pH uvnitř buněk s velkou citlivostí.

Nitrobuněčné pH je obecně v cytosolu mezi 6,8 a 7,4 a v kyselých organelách mezi 4,5 a 6,0.

Je tedy potřeba měřit změny pH v oblasti desetin jednotek pH. Hlavní skupiny indikátorů pH

jsou uvedeny v Tabulce 2.13. Příklad měření se sondou SNARF-5F je popsán v kapitole 3.8.

Tabulka 2.13 Fluorescenční indikátory pH

Ex – značí měření při uvedené vlnové délce excitace, Em – značí měření při uvedené vlnové délce emise,

dvojice čísel oddělená lomítkem značí poměrné měření při dvou různých vlnových délkách

(Podle: Handbook of Fluorescent Probes and Research Products.)

Fluorescein byl použit jako jeden z prvních indikátorů pH, především pro měření

nitrobuněčných hodnot. Protože fluorescein se poměrně snadno z buněk uvolňuje jsou často

používány jeho vysoce nabité deriváty, jako 5(6)-karboxyfluorescein nebo 2',7'-bis-(2-

karboxyetyl)-5-(a 6)-karboxyfluorescein (BCECF). Do živých buněk se tyto sondy snadno

dostávají jako acetoxymetylové (AM) nebo acetátové estery.

Fluorescein samotný je středně vhodná sonda. Poměr intenzit fluorescence změřené při dvou

excitačních vlnových délkách (λ1=450 nm, λ2=495 nm) se zvyšuje se zvyšujícím se pH.

Nevýhodou fluoresceinu je skutečnost, že jeho pKa je kolem 6,5, tedy mimo optimální rozsah

běžných fyziologických pH.

Jako sonda pro poměrné měření fluorescence při dvou různých vlnových excitačních

vlnových délkách je vhodnější sonda 8-hydroxypyrén-1,3,6-trisulfonát (HPTS; pyranin),

kdy se měří poměr intenzit fluorescence při buzení λ1=420 nm a λ2=450 nm. Zdánlivá pKa

této sondy je kolem 7,5.

Novější skupinou pH sond jsou seminaftofluoresceiny (SNAFL) a seminaftorhodafluory

(SNARF). Vyznačují se tím, že mají velký posuv jak v absorpčním, tak v emisním spektru a

mohou být tedy použity pro poměrná měření jak pro dvojici excitačních, tak pro dvojici

emisních vlnových délek.

Obr. 2.6 Absorpční a fluorescenční spektra fluoresceinu při různých hodnotách pH

(Podle: Handbook of Fluorescent Probes and Research Products.)

2.3.7. Membránový potenciál

V důsledku nerovnoměrného rozdělení iontů, především Na+, K+ a Cl- mají buněčné

plazmatické membrány transmembránový potenciál kolem -70 mV (negativní uvnitř buňky).

Depolarizace a hyperpolarizace membrán má klíčovou úlohu v řadě buněčných procesů,