Fluorofory v biomedicíně

fluoreskujících produktů. Obecně se postupuje tak, že acetátový nebo

acetoxymetylový ester vhodného fluoroforu se rozpustí v DMSO (dimetylsulfoxid)

v koncentraci 1-10 mmol/l a poté se přidá k buňkám v konečné koncentraci 1-25

μmol/l. Jednou z prvních sond pro toto použití byl fluorescein diacetát (FDA). Mezi

nejlepší indikátory životnosti buněk patří calcein AM (díky vysokému záchytu

v živých buňkách a silné fluorescenci). Dalšími vhodnými indikátory životnosti jsou

např. 2',7'-bis-(2-karboxyetyl)-5-(a 6)- karboxyfluorescein, acetoxymetyl ester

(BCECF, AM), karboxyeosin diacetát, karboxyfluorescein diacetát, …

2. Barviva pro nukleové kyseliny, která neprostupují membrány živých buněk (viz Tab.

2.6) a lze je proto použít pro detekci mrtvých buněk. Mezi takové indikátory patří

např. ethidium bromid, ethidium homodimer-1, propidium jodid, SYTOX Green,

cyaninová barviva, jako TOTO, a další. Používají se často v kombinaci

s nitrobuněčnými substráty esteráz, membránově propustnými barvivy nukleových

kyselin, sondami citlivými na membránový potenciál, sondami pro organely nebo

indikátory propustnosti membrán.

3. Sondy, které jsou aktivními buňkami oxidovány nebo redukovány a umožňují tak

měřit redox potenciál buněk jako znak jejich životnosti; např. resazurin, tetrazoliové

soli.

4. Sondy citlivé na transmembránový potenciál, pH nebo Ca2+ (viz kap. 2.3.5-7).

Tabulka 2.7 Fluorescenční sondy pro měření životnosti buněk

(Podle: Handbook of Fluorescent Probes and Research Products.)

Testování proliferace buněk je založeno na měření růstové rychlosti buněčné populace nebo

na detekci dceřiných buněk v rostoucí populaci. Běžně neexistuje fluorofor, který by se

specificky inkorporoval do buněk během dělení. Proliferační testy obvykle určují počet buněk

z inkorporace [3H]-thymidinu nebo 5-bromo-2´-deoxyuridinu (BrdU, thymidinový analog).

Fluorescenčně lze měřit např. změny v obsahu nukleových kyselin pomocí fluorescenčních

sond (viz kap. 2.2.2) nebo pomocí fluorescenčně značených protilátek (např. anti-BrdU).

Apoptóza (programovaná buněčná smrt) je geneticky kontrolované odstraňování buněk

během vývoje. Apoptóza je odlišná od nekrózy jak biochemickými, tak morfologickými

změnami, které ji charakterizují. Fluorescenčně lze apoptózu testovat např.:

• s použitím sond pro nukleové kyseliny

• s použitím konjugátů annexinu V

• měřením aktivity specifických proteáz

• měřením změn mitochondrií, peroxidace lipidů, změn nitrobuněčného pH a iontů

2.3.2. Studium neurotransmiterových receptorů a iontových

kanálů

Funkce neurotransmiterových receptorů a iontových kanálů je klíčová v transdukci nervového

signálu studovaného v neurovědách. Existuje řada fluorescenčně značených ligandů (agonistů

i antagonistů) pro tyto receptory (Tabulka 2.8) a iontové kanály nebo iontové přenašeče