Fluorofory v biomedicíně

Obr. 2.1 Absorpční a fluorescenční spektrum fluoresceinu (pH 9,0)

(Podle: Handbook of Fluorescent Probes and Research Products.)

Obr. 2.2 Fluorescein-5-izothiokyanát

Další často používanou fluorescenční značkou je dansyl chlorid (DNS-Cl), který stejně jako

FITC reaguje s volnými aminoskupinami proteinů. Může být excitován při 350 nm (tj. mimo

oblast vlastní absorpce proteinů) a emituje kolem 520 nm, přičemž jeho emisní spektrum je

silně závislé na polaritě prostředí.

Nová skupina fluorescenčních značek, jejichž fluorofor obsahuje bór, je zavedena pod

značkou BODIPY. Jejich výhodou je vysoký kvantový výtěžek fluorescence, možnost použít

různé deriváty s emisí v širokém rozsahu 510-675 nm, vysoký extinkční koeficient,

nezávislost na polaritě okolí a na pH. Jejich nevýhodou je malý Stokesův posuv. Používají pro

značení proteinů, nukleotidů, oligonukleotidů a dextranů, enzymových substrátů, mastných

kyselin, fosfolipidů, lipopolysycharidů, receptorových ligandů (viz kap. 3.10.1) a

polystyrénových mikrokuliček.

Akrylodan je reaktivní forma prodanu (6-propionyl-2-dimetylaminonaftalénu), jehož

fluorescenční vlastnosti jsou vysoce závislé na polaritě okolního prostředí (na rozdíl od FITC,

TRITC, BODIPY).

Pro detekci a kvantifikaci nízkomolekulárních aminů (např. řady léčiv) lze použít značky,

které fluoreskují poté, co vytvoří konjugát s amino skupinou. Např. fluorescamin nebo NBD

chlorid reagují rychle s aminy a teprve poté fluoreskují.

Tabulka 2.2 Fluorescenční parametry vybraných fluorescenčních značek

(Podle: 1. Lakowicz 1999; 2. Handbook of Fluorescent Probes and Research Products.)

Další možností je syntéza chemického analogu molekuly, který zachovává chemické

vlastnosti původní molekuly, ale na rozdíl od ní vykazuje fluorescenci. Například adenosin

trifosfát (ATP) nefluoreskuje, ale jeho analog etheno-ATP je fluorofor, i když některé

vlastnosti ATP jsou narušeny. Také byly syntetizovány fluorescenční analogy bazí DNA,

adeninu (2-aminopurin) a guaninu (izoxantopterin). Pro studium interakcí steroidů s

membránami mohou být využity fluorescenční analogy cholesterolu (dehydroergosterol)

nebo estradiolu (azatetrahydrochrysen). Existují i sondy, které fluoreskují pouze ve

viskózním prostředí (např. 9-(2-karboxy-2-cyanovinyl)julolidin, CCVJ) a mohou být

použity pro studium viskozity membrán a rigidity vazebných míst na proteinech.

2.2.2. Fluorescenční sondy

Fluorescenční sondy jsou nevlastní fluorofory, které se ke sledované struktuře vážou

nekovalentně a často přitom mění své fluorescenční vlastnosti. Volba fluorescenční sondy je

klíčovou součástí experimentu ve fluorescenční spektroskopii, neboť právě její vlastnosti

umožňují získat potřebné informace. Jsou známy tisíce sond, jejichž relativně nejúplnější

přehled lze nalézt na webových stránkách firmy Molecular Probes, avšak podrobnější