Fluorofory v biomedicíně

2. Fluorofory v biomedicíně

Fluorofory se dělí do dvou obecných tříd:

• vnitřní (vlastní, intrinsic) – vyskytují se přirozeně

• vnější (nevlastní, extrinsic) – jsou přidány ke vzorkům, které nemají vhodné

fluorescenční vlastnosti

2.1. Vlastní fluorescence

Vlastní fluorescence buněk je dána především těmito složkami:

• proteiny – fluorescence v ultrafialové oblasti

• redukované formy nikotinamidadenindinukleotidu (NADH),

nikotinamidadenindinukleotid fosfátu (NADPH), oxidované formy flavoproteinů,

vitamin A – fluorescence ve viditelné oblasti (modrá až žlutá)

• cytochromy, peroxidáza, hemoglobin, myoglobin, chlorofyl – fluorescence ve

viditelné oblasti (červená)

Fluorescence proteinů

V proteinech jsou hlavními fluorofory aromatické aminokyseliny tryptofan (Try), tyrozin

(Tyr) a fenylalanin (Phe). Jejich absorpční pás leží mezi 240 a 300 nm, emise je rovněž

v ultrafialové oblasti (Tabulka 2.1). Dominantním fluoroforem je tryptofan, resp. jeho

indolová skupina, neboť má mnohem širší emisní spektrum než tyrozin, jehož fluorescenci

umožňuje jeho fenolový kruh. Fenylalanin se na celkové fluorescenci bílkovin prakticky

nepodílí.

Fluorescence tryptofanu je velmi citlivá na vlastnosti jeho okolí a lze ji proto použít pro

sledování konformačních změn proteinů (např. při vazbě ligandů nebo při interakcích proteinprotein).

Tabulka 2.1 Fluorescenční parametry tryptofanu, tyrozinu a fenylalaninu

(Podle: Lakowicz 1999.)

Existuje několik tříd proteinů, které mají vlastní fluorescenci při delších vlnových délkách:

• fykobiliproteiny (z cyanobakterií a modro-zelených a červených řas), které absorbují

od 470 do 650 nm (tj. v oblasti, kde neabsorbuje chlorofyl); jako fluorofory mají řadu

výhod:

o intenzivní dlouhovlnná excitace a emise (neinterferují s vlastní fluorescencí

jiných biologických molekul)

o relativně velký Stokesův posuv a vysoký kvantový výtěžek emise

o fluorescence není zhášena vnějšími zhášedly

o vysoká rozpustnost ve vodě

o homogenní struktura s definovanou molekulovou hmotností

o vícero míst pro stabilní konjugaci s mnoha biologickými i syntetickými

látkami

• zelený fluorescentní protein (green fluorescent protein, GFP) z bioluminiscentní

medúzy

• fytofluory – fluorescenční sondy odvozené od fytochromů (proteinů citlivých na

světlo, které jsou přítomny ve fotosyntetizujících organismech)

Fluorescence enzymových kofaktorů

• NADH silně fluoreskuje (λex

max ≅ 340 nm, λem

max ≅ 460 nm), zatímco jeho oxidovaná

forma NAD+ nikoli; fluoreskující skupinou je redukovaný nikotinamidový kruh. Po

vazbě NADH k proteinům se jeho fluorescence obvykle několikanásobně zvyšuje (ale

může se i snížit), zřejmě v závislosti na omezení kontaktu fluoreskující

nikotinamidové skupiny a adeninu, který fluorescenci částečně zháší.

• Pyridoxal fosfát je rovněž fluorofor; jeho fluorescenční parametry závisí na jeho