Fluorofory v biomedicíně

DMF – dimetylformamid, MeCN – acetonitril, DMSO –dimetylsulfoxid, MeOH - metanol

(Podle: Handbook of Fluorescent Probes and Research Products.)

Sondy pro membránový potenciál

Významnou skupinu membránových sond tvoří sondy citlivé na membránový potenciál. Patří

se např. merocyanin 540, karbocyaniny (např. 3,3'-dihexyloxakarbocyanin jodid, DiOC6(3),

viz kap. 3.7) a styrylové sondy (kap. 2.3.7).

Fluorescenční sondy pro nukleové kyseliny

Nukleotidy a nukleové kyseliny obecně nefluoreskují. Výjimkou je kvasinková tRNAPE, která

obsahuje vysoce fluorescentní bázi známou jako Yt-báze (λem

max ≅ 470 nm). DNA je tedy jen

slabě fluorescentní nebo nefluorescentní. Pro vizualizaci a identifikaci chromozomů se proto

používá řada fluorescenčních sond jako jsou akridinová oranž, ethidium bromid,

propidium jodid, Hoechst 33342, 4',6-diamidino-2-fenylindol dihydrochloride (DAPI) a

další. Kromě těchto klasických barviv se používají také cyaninová barviva pro stanovení

nukleových kyselin v roztocích, gelech a blotech, procházející či neprocházející membránou

živých buněk (Tabulka 2.6)

Tabulka 2.6 Některé fluorescenční sondy pro nukleové kyseliny

(Podle: Handbook of Fluorescent Probes and Research Products.)

Po vazbě k dvouřetězcovým nukleovým kyselinám se silně zvyšuje např. kvantový výtěžek

fluorescence sondy 2,7-diamino-10-etyl-9-fenylfenanthridium bromid (ethidium bromid,

EB) s λem max = 605 nm. Výraznou červenou fluorescenci této sondy vázané do buněčných

jader lze velmi dobře pozorovat ve fluorescenčním mikroskopu i měřit na spektrofluorimetru

(viz experiment popsaný v kapitole 3.5). Další často používanou sondou pro stanovení

nukleových kyselin je akridinová oranž, která v monomerní formě fluoreskuje s λem

max =530 nm, v dimerní formě (při vyšších koncentracích) s λem max = 640 nm. Zelená monomerová fluorescence pochází z komplexů monomerů s dvouřetězcovými DNA nebo RNA, zatímco oranžová fluorescence pochází od komplexů dimerů sondy s jednořetězcovými nukleovými kyselinami. Spektrální parametr daný poměrem intenzit oranžové a zelené fluorescence (I640/I540) akridinové oranže charakterizuje stupeň spirálnosti nukleových kyselin. Např. ve zralých diferencovaných buňkách lymfocytů z periferní lidské krve je možno zanedbat podíl jednořetězcových DNA na oranžové fluorescenci a parametr I640/I540 charakterizuje poměr RNA/DNA v buňkách.

Obr. 2.4 Fluorescenční sondy pro nukleové kyseliny

Fluorescenční sondy pro přenos energie

Pomocí fluorescenčních sond lze studovat přenos energie od absorbujícího donoru

k emitujícímu akceptoru, který se nalézá ve vzdálenosti RDA od donoru (viz kapitola 1.4). Lze

tak ze změny spekter fluoroforu určovat vzdálenost mezi skupinami (v oblasti 1,5-6,5 nm) a

studovat přenos energie v proteinech. Vhodné je pro tato měření použití časově rozlišené