Fluorofory v biomedicíně

indikátoru bereme v úvahu:

• formu indikátoru (sůl, acetoxymetyl ester, dextranový konjugát), která ovlivňuje

způsob, jakým se dostává do buňky (mikroinjekce, elektroporace, infúze z patchpipety,

pasivní difúze) a nitrobuněčnou distribuci

• způsob měření – některé indikátory vykazují po vazbě iontu spektrální posuv

absorpce nebo emise (měří poměr intenzit při různých vlnových délkách excitace nebo

emise), jiné změnu intenzity fluorescence

• disociační konstantu – musí být srovnatelná s měřenou koncentrací kationu

(koncentrace menší než desetina nebo věší než desetinásobek disociační konstanty

způsobují příliš malé změny v pozorovaném signálu)

Koncentrace sondy je v těchto měřeních mnohem menší, než koncentrace stanovované látky

(analytu), neboť jinak by docházelo ke zkreslení koncentrací volného analytu. Pro sondy,

které vykazují změnu intenzity fluorescence, ale nikoli spektrální posuv (jako je Calcium

Green, Fluo-3, Rhod-2, Quin-2) je koncentrace analytu ca dána vztahem:

(2.1) ca = Kd (I-Imin)/(Imax-I)

kde je Kd – disociační konstanta vazebného místa pro analyt na indikátoru, Imin – intenzita

fluorescence indikátoru, když není navázán žádný analyt, Imax – intenzita fluorescence plně

obsazeného indikátoru, I – intenzita fluorescence ve vzorku, kde je jen část vazebných míst

indikátoru obsazena analytem. Změny v intenzitě fluorescence jsou typicky způsobeny

změnou kvantového výtěžku fluorescence po navázání analytu, spíše než změnou v absorpci.

Měření Imax a nitrobuněčná kalibrace indikátorů se dělá pomocí ionoforů nebo uvolněním

indikátoru do media o známé koncentraci analytu lýzou buněk.

Pro sondy, které vykazují spektrální posuv v absorpčním nebo emisním spektru po vazbě

analytu se koncentrace analytu určuje z poměru intenzit nezávisle na celkové koncentraci

sondy. Při měření poměru intenzit fluorescence při dvou různých excitačních vlnových

délkách, je koncentrace analytu určována ze vztahu:

(2.2) ca = Kd (SF(λ2)/SB(λ2)) (R – Rmin)/(Rmax – R)

kde R=I(λ1)/I(λ2) je poměr intenzit pro dvě excitační vlnové délky λ1 a λ2, Rmin a Rmax jsou

poměry pro sondu volnou a plně obsazenou analytem, SF(λ2)/SB(λ2)=εFΦF/εBΦB, ε - extinkční

koeficienty, Φ - kvantové výtěžky sondy excitované při λ2.

Při měření poměru intenzit fluorescence při dvou různých emisních vlnových délkách lze

použít rovnici analogickou rovnici (2.2), přičemž SF(λ2)/SB(λ2)=IF/IB je poměr intenzit volné a

vázané formy.

Vybrané fluorescenční indikátory pro Ca2+ jsou uvedeny v Tabulce 2.12. Fluorescenčním

indikátorem pro Mg2+ je např. Mag-Fura-2 nebo Mag-Indo-2; pro zinek FuraZin-1, IndoZin-1,

FluoZin-1, pro Na+ je to sodík vázající benzofuran izoftalát (SBFI) a sodík vázající

benzofuran oxazol (SBFO), pro K+ např. draslík vázající bezofuran izoftalát (PBFI).