Fluorofory v biomedicíně

dostáváme až do oboru milisekund. Podle rychlosti sledovaného pohybu je nutno vybrat

vhodnou metodu a sondu. Fluorescenční měření postihují oblast 10-7-10-10 s, fosforescence 10-

3-102 s, metoda spinových sond 10-7-10-10 s, metoda elektronové spinové rezonance

s přenosem nasycení prodlužuje škálu do 10-4 s. V dalším textu bude vysvětlován význam a

možnosti stanovení difúzních koeficientů, korelačních časů a parametrů pořádku pomocí

metod fluorescenční spektroskopie.

Rotační difúze v izotropním systému

Měření koeficientu viskozity, resp. mikroviskozity biologických membrán fluorescenčními

metodami spočívá obvykle v měření rotační depolarizace fluorescence vhodných molekul

(sond) vázaných v membráně. K depolarizaci fluorescence těchto molekul buzených

polarizovaným zářením dochází rotací molekul (tepelným Brownovým pohybem) v době

mezi absorpcí a emisí. Tato doba je pro každou sondu jiná, pohybuje se však vesměs v oblasti

nanosekund, a je jí určen rozsah rychlostí detekovaných jevů v membráně.

Experimenty jsou prováděny dvěma základními způsoby:

1. stacionární metodou (ustálená fluorescence) s kontinuálním buzením a snímáním

fluorescence;

1. kinetickou metodou (časově rozlišená fluorescence) s pulzním buzením fluorescence a

měřením průběhu jejího dohasínání .

Obvyklé uspořádání těchto experimentů je na Obr. 1.5 v kapitole 1.3, kde jsou také definice

základních pojmů, které zde nicméně zopakuji:

stupeň polarizace

(2.7) p = (III - I⊥)/((III + I⊥) = 3 r/(2 + r) = (1 - δ)/(1 + δ)

anizotropie fluorescence

(2.8) r = (III - I⊥)/((III + 2 I⊥) = 2 p/(3 – p) = (1 - δ)/(1 + 2 δ)

depolarizační faktor

(2.9) δ = I⊥/III

kde III a I⊥ jsou složky světelné intenzity rovnoběžné nebo kolmé ke směru polarizace

budícího záření.

V kinetické metodě jsou měřeny zvlášť dvě křivky dohasínání III(t) a I⊥(t) a anizotropie

fluorescence je časově závislá. Pro sférickou molekulu v izotropním prostředí je tato časová

závislost popsána jednoduchou exponenciálou

(2.10) r(t) = (III(t) - I⊥(t))/((III(t) + 2 I⊥(t)) = r0 exp(-t/τr)

(2.11) I(t) = III(t) + 2 I⊥(t) = I0 exp(-t/τ)

kde je r0 – limitní hodnota anizotropie při vyloučení tepelného pohybu molekuly, I0 –

počáteční hodnota intenzity fluorescence, τ - doba života fluorescence (doba dohasínání), τr -

rotační korelační čas (τr = 1/6Dr) zavedený pomocí rotační difúzní konstanty Dr, pro

kterou v případě sférické částice platí Stokesův-Einsteinův vztah (viz rovnice 2.4 a 2.5)

(2.12) Dr = kT/6Vη

kde je V – objem částice, η – viskozita prostředí, k – Boltzmannova konstanta (=1,380662.10-

23 J.K-1), T – absolutní teplota.

Při určování rotačního korelačního času sférické molekuly v izotropním prostředí z měření

ustálené fluorescence lze použít Perrinovu rovnici, kterou dostaneme jednoduchým