Fluorofory v biomedicíně

fluorescence.

2.2.3. Fluorescenční indikátory (chemické sondy)

Jako fluorescenční indikátory jsou označovány fluorofory jejichž spektrální vlastnosti jsou

citlivé na určitou látku. V současné době jsou dostupné fluorescenční indikátory pro řadu

látek, včetně vápníku, hořčíku, sodíku, chlóru, kyslíku, fosfátu, aminů a pro pH. Obvykle tyto

indikátory buď

1. vykazují spektrální posuv v závislosti na přítomnosti dané látky, jejíž koncentrace se

potom určuje z poměru intenzit při různých vlnových délkách excitace nebo emise,

2. nebo se jedná o indikátory, které vykazují zvýšení intenzity fluorescence v přítomnosti

dané látky, aniž by docházelo ke spektrálnímu posuvu.

Příklady:

• N-(etoxykarbonylmetyl)-6- metoxyquinolinium bromid (MQAE) je srážkovým

mechanismem zhášen chlórem a tuto sondu lze tedy použít pro měření změn koncentrací Cl-

• PBFI je fluorescenční indikátor citlivý na draslík

• Fura-2 je indikátor vykazující spektrální posuv v přítomnosti Ca2+

• Calcium green vykazuje zvýšenou intenzitu fluorescence v přítomnosti Ca2+, aniž by

docházelo ke spektrálnímu posuvu

• SNARF-5F je indikátor pH (viz kap. 3.8)

Pro studium živých buněk jsou užitečné acetoxymetylové (AM) a acetátové estery

fluorescenčních indikátorů, protože zatímco původní indikátor neprochází buněčnou

membránou, jeho AM nebo acetátový ester tak snadno činí (nenabitá molekula). Uvnitř buňky

vzniká působením nespecifických esteráz původní indikátor. Příkladem je fluorescein

diacetát, Quin-2 AM, Fura-2 AM a další.

2.3. Příklady použití

Některé příklady použití fluorescenčních sond a značek byly uvedeny již v předchozí kapitole.

V oblasti neurověd se nejčastěji jedná o využití fluorescenční spektroskopie při sledování

změn nitrobuněčných iontů a pH, membránového potenciálu, polarity okolí, „fluidity“

membrán, přenosu energie mezi molekulami, sledování enzymových reakcí, analýze DNA a

při použití imunochemických (značené protilátky) a radiochemických (scintilační roztoky)

metod.

2.3.1. Testování životnosti buněk, jejich proliferace a funkcí

Testování životnosti buněk, jejich proliferace a funkcí (včetně apoptózy, adheze buněk,

chemotaxe, multidrug rezistence, endocytózy, sekrece a přenosu signálu) lze provádět pomocí

fluorescenčních testů, které jsou mnohem citlivější než testy kolorimetrické a bezpečnější a

levnější než testy využívající radionuklidy.

Testování životnosti a cytotoxicity je založeno na měření podílu živých a mrtvých buněk

v populaci. Jako sondy životnosti buněk slouží:

1. Fluorogenní substráty esteráz, které mohou pasivně pronikat do buněk a měří jednak

zachování enzymatické aktivity buněčných esteráz, které je převádí na fluoreskující

produkt, jednak membránovou integritu, která zajišťuje nitrobuněčnou retenci jejich