Fluorofory v biomedicíně

chemické struktuře v proteinu.

• Flavin adenin dinukleotid (FAD), riboflavin a flavin mononukleotid (FMN)

absorbují kolem 450 nm a emitují kolem 525 nm. Fluorescence flavinu je zhášena

adeninem. Fluorescenční vlastnosti mají oxidované formy flavinů, nikoli redukované,

jako je tomu u NADPH.

2.2. Nevlastní fluorescence

Vnější, neboli nevlastní fluorofory se používají mnohem více než vnitřní. Přidávají se ke

studovanému vzorku a pokud se na něj váží kovalentně, nazývají se fluorescenční značky,

pokud se váží nekovalentně jedná se fluorescenční sondy.

Nevlastní fluorofory lze dělit do dvou skupin:

1. látky, jejichž kvantový výtěžek fluorescence se nemění po jejich zavedení do

biologického systému - jedná se o fluorescenční barviva používaná v klasické

fluorescenční cytochemii (např. fluorescein, akridinová oranž, eozin, …)

2. látky, jejichž kvantový výtěžek fluorescence se silně mění při vazbě na buněčné struktury

a závisí na bezprostředním okolí fluoroforu (např. 1-anilinonaftalén-8-sulfonát, 1,6-

difenyl-1,3,5-hexatrien, …)

Kromě požadavku na specifickou vazbu nevlastního fluoroforu k buněčným složkám a

citlivosti emise fluoroforu na změny v okolí, je důležité, aby zavedením fluoroforu do

bílkovin, nukleových kyselin, membrán apod. nedošlo k narušení funkce těchto biologických

systémů.

2.2.1. Fluorescenční značky

Fluorescenční značky jsou nevlastní fluorofory, které se ke sledovaným biomolekulám

(proteinům, peptidům, ligandům, oligonukleotidům a jiným) vážou kovalentní vazbou.

Nejčastěji se používají k fluorescenčnímu značení proteinů, kdy se kovalentně vážou na jejich

aminové, sulfhydrylové nebo histidinové boční řetězce, thiolové skupiny atd. Různé aplikace

v imunologii, histochemii, afinitní chromatografii apod. využívají také vysokou afinitu a

specificitu interakcí avidin-biotin a protilátka-hapten, kdy je studovaná molekula (protilátka,

lektin, léčivo, polynukleotid, polysacharid, receptor) označena biotinem nebo haptenem a poté

detekována fluorescenčně značenou protilátkou k biotinu nebo haptenu.

Mezi významné fluorescenční značky patří:

• fluorescein-5-izothiokyanát (FITC)

• dansyl chlorid (DNS-Cl; 5-dimetylaminonaftalén-1-sulfonyl chlorid)

• 5-jodoacetamidofluorescein (5-IAF)

• tetrametylrhodamin-5(a 6)-izothiokyanát (TRITC)

• 4-chloro-7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol (NBD-Cl; 4-chloro-7-nitrobenzofurazan)

• 6-akryloyl-2-dimetylaminonaftalén (akrylodan)

Nejznámějšími fluorescenčními značkami jsou fluoresceinizothiokynát (FITC) a

tetrametylrhodaminizothiokyanát (TRITC), které se používají v imunofluorescenčních

metodách. Jejich fluorescenční parametry jsou uvedeny v tabulce 2.2. Eosin (2´,4´,5´,7´-

tetrabromofluorescein) a erytrosin (2´,4´,5´,7´-tetrajodofluorescein) se obvykle používají

jako fosforescenční sondy.