Fluorofory v biomedicíně
Níže je uveden pouze náhled materiálu. Kliknutím na tlačítko 'Stáhnout soubor' stáhnete kompletní formátovaný materiál ve formátu DOCX.
chemické struktuře v proteinu.
• Flavin adenin dinukleotid (FAD), riboflavin a flavin mononukleotid (FMN)
absorbují kolem 450 nm a emitují kolem 525 nm. Fluorescence flavinu je zhášena
adeninem. Fluorescenční vlastnosti mají oxidované formy flavinů, nikoli redukované,
jako je tomu u NADPH.
2.2. Nevlastní fluorescence
Vnější, neboli nevlastní fluorofory se používají mnohem více než vnitřní. Přidávají se ke
studovanému vzorku a pokud se na něj váží kovalentně, nazývají se fluorescenční značky,
pokud se váží nekovalentně jedná se fluorescenční sondy.
Nevlastní fluorofory lze dělit do dvou skupin:
1. látky, jejichž kvantový výtěžek fluorescence se nemění po jejich zavedení do
biologického systému - jedná se o fluorescenční barviva používaná v klasické
fluorescenční cytochemii (např. fluorescein, akridinová oranž, eozin, …)
2. látky, jejichž kvantový výtěžek fluorescence se silně mění při vazbě na buněčné struktury
a závisí na bezprostředním okolí fluoroforu (např. 1-anilinonaftalén-8-sulfonát, 1,6-
difenyl-1,3,5-hexatrien, …)
Kromě požadavku na specifickou vazbu nevlastního fluoroforu k buněčným složkám a
citlivosti emise fluoroforu na změny v okolí, je důležité, aby zavedením fluoroforu do
bílkovin, nukleových kyselin, membrán apod. nedošlo k narušení funkce těchto biologických
systémů.
2.2.1. Fluorescenční značky
Fluorescenční značky jsou nevlastní fluorofory, které se ke sledovaným biomolekulám
(proteinům, peptidům, ligandům, oligonukleotidům a jiným) vážou kovalentní vazbou.
Nejčastěji se používají k fluorescenčnímu značení proteinů, kdy se kovalentně vážou na jejich
aminové, sulfhydrylové nebo histidinové boční řetězce, thiolové skupiny atd. Různé aplikace
v imunologii, histochemii, afinitní chromatografii apod. využívají také vysokou afinitu a
specificitu interakcí avidin-biotin a protilátka-hapten, kdy je studovaná molekula (protilátka,
lektin, léčivo, polynukleotid, polysacharid, receptor) označena biotinem nebo haptenem a poté
detekována fluorescenčně značenou protilátkou k biotinu nebo haptenu.
Mezi významné fluorescenční značky patří:
• fluorescein-5-izothiokyanát (FITC)
• dansyl chlorid (DNS-Cl; 5-dimetylaminonaftalén-1-sulfonyl chlorid)
• 5-jodoacetamidofluorescein (5-IAF)
• tetrametylrhodamin-5(a 6)-izothiokyanát (TRITC)
• 4-chloro-7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol (NBD-Cl; 4-chloro-7-nitrobenzofurazan)
• 6-akryloyl-2-dimetylaminonaftalén (akrylodan)
Nejznámějšími fluorescenčními značkami jsou fluoresceinizothiokynát (FITC) a
tetrametylrhodaminizothiokyanát (TRITC), které se používají v imunofluorescenčních
metodách. Jejich fluorescenční parametry jsou uvedeny v tabulce 2.2. Eosin (2´,4´,5´,7´-
tetrabromofluorescein) a erytrosin (2´,4´,5´,7´-tetrajodofluorescein) se obvykle používají
jako fosforescenční sondy.