skripta

a proto jsou užívány i pro fixaci při elektronmikroskopických studiích. Z nich však např. osmium  tetroxid podstatně
omezí paletu využitelných barvících technik pro světelnou mikroskopii. Při studiu tuků a tukovitých látek je k fixaci
nutné užít  formaldehyd či jinou podobnou fixační tekutinu,  která neatakuje tuky, případně je učiní méně rozpustnými
(např.Ca++-formol). Současně je nutné při  dalším zpracovávání se vystříhat koncentrovaného  alkoholu a všech tuko-
vých rozpustidel. Při studiu  distribuce glykogenu naopak musí pracovník užít  alkohol nebo často jinou alkoholickou
fixaci  (např. Gendre - nasycený roztok kys. pikrové v alkoholu + formol + kys. octová), neboť jinak dojde  k jeho i
úplnému vyplavení z buněk.
 V řadě případů je možné využít metody  freezing-drying (zmrazení tkáně a její vakuové  vysušení ve zmrzlém stavu).
Ovšem i tato technika  má svá úskalí. Je možno zpracovávati jen drobné  kousky tkání, protože v bloku hlouběji uložené
buňky promrzají pomalu (stačí se vytvořit ledové  krystaly, které roztrhají buňky) a tak centrální  části bloku jsou zni-
čené.
 Z těchto několika řádek vyplývá, že obvykle  fixace musí být volena dle toho, zda pracovník  chce studovat obecnou
strukturu nebo určité  buněčné komponenty.

1.2. Zalévání
 Aby bylo možné zhotovit dostatečně tenké  a kvalitní řezy pro mikroskopické studium, je téměř vždy nutné tkáň zalít
do média, které ji zpevní a vytvoří dostatečně homogenní blok, dovolující  krájení. Pro světelně mikroskopické studium
zpravidla užíváme řezy tlusté 4-20 µm (1µm = 1 x 10-3mm), pro elektronmikroskopické účely zpravidla řezy silné 100
nm a tenčí (1 nm = 1 x 10-6 mm).
 Nejběžněji pro světelnou mikroskopii užíváme  zalévání do parafínu, případně celloidinu (nitrocelulozy), méně časté
je pouhé zmrazení fixované  tkáně a krájení na zmrazovacím mikrotomu, případně  v kryostatu. Pro elektronmikrosko-
pické studium je  běžné zalévání do různých epoxidových nebo polyesterových pryskyřic (Viz Tab.5.).
Většina těchto zalévacích médií však není mísitelná s vodou a proto musí být tkáň odvodněná  a prosycená médiem, ve
kterém se zalévací hmota  rozpouští. Obvykle se tkáň odvodňuje stoupající  řadou alkoholů (etylakohol 70%, 80%,
90%, 96%  a absolutní). Po odvodnění musí být tkáň ještě  prosycená rozpouštědlem zalévacího média. Pro parafín je to
nejčastěji toluen, pro celloidin  alkohol-éter, pro epoxidové pryskyřice 1,2-epoxipropan a pro polyestery zpravidla ace-
ton. Protože  parafín je při běžné pokojové teplotě tuhý, tkáň,  kterou takto zaléváme, musí být vystavena zvýšené  tep-
lotě (cca 60° C), kdy parafín je již tekutý.  Obdobně i tkáně zalévané do epoxidových či polyesterových pryskyřic musí
být vystaveny vyšší teplotě - při ní tyto pryskyřice polymerují. Bohužel  zvýšená teplota snižuje aktivitu četných en-
zymů,  některé prakticky zničí, a tak pro jejich průkaz  je pracovník nucen užít jiné techniky. Zvýšená  teplota rovněž
vede k smršťování tkáně. Při zalévání pro elektronovou mikroskopii, při polymeraci  většiny pryskyřic, vzniká další
teplo (polymerace  je exotermickou reakcí), které může rovněž značně poškodit zalévanou tkáň.
 Jak bylo již uvedeno výše, přechod tkání přes  tuková rozpustidla tuky vyplaví a při studiu tuků  je nutno užít tedy jiné
metody přípravy preparátu.  V prvé řadě je to zmrazení fixovaných nebo nefixovaných kousků tkáně a jejich nakrájení
buď na  zmrazovacím mikrotomu nebo v kryostatu. Princip  chlazení starších zmrazovacích mikrotomů je zmrazení
kousku tkáně, případně i chlazení nože mikrotomu, proudem tekutého (vysoce stlačeného) kysličníku uhličitého (CO2),