skripta

1.5.3. Metachromazie
 V  četných tkáních můžeme určité komponenty  zobrazit metachromaticky, to znamená, že zatímco  některé složky
tkáně se barví v základním odstínu  barviva (nejčastěji modře - thioninem nebo toluidinovou modří), jiné se zbarví
metachromaticky  (týmž barvivem purpurově). Jedná se téměř výlučně  o thiazinová barviva, která vykazují tuto schop-
nost. V základním odstínu barviva (tj. ortochromaticky) se vybarví místa, kde se barvivo váže  elektrostaticky. V mís-
tech, kde je značné nahromadění aniontů, které vytvoří polyanionický polymer, se barvivo váže s těmito komponentami.
Nejčastěji jsou to např. glykosaminoglykany. Zdá se  však, že chemické složení není pro metachromazii  tak důležité,
jako distribuce a hustota těchto  anionických skupin.

1.5.4. Histochemické reakce na enzymy
 Podmínkou  úspěšného provedení těchto reakcí je  zachování enzymatické aktivity během fixace a zalití. Proto řada
citlivějších enzymů může být prokázána pouze na nefixovaných, kryostatových řezech.
 Obecný princip  těchto reakcí si však můžeme demonstrovat na nejstarších průkazech enzymů - např. na  Gomoriho
průkazu kyselé fosfatázy. Řez tkání (se  zachovanou aktivitou enzymu) je inkubován v roztoku substrátu, který je en-
zym schopen štěpit (např.  ß-glycerofosfát). Štěpením je uvolněn fosfátový  iont, který je ihned na místě uvolnění za-
chycen  olovnatými kationty a vytvoří nerozpustnou sloučeninu (která není viditelná ve světelném mikroskopu, posky-
tuje však kontrastní obraz v mikroskopu  elektronovém). Pro světelně mikroskopický průkaz  se v další etapě řezy pře-
vedou do sirníku amonného, kde precipitát se změní na černý sirník olovnatý.  Podobným mechanismem je možné v
současné době prokazovat řadu enzymů s tím rozdílem, že štěpený  substrát uvolňuje jiné sloučeniny, které jsou přemě-
něny na barevný produkt (např. diazo-reakce) nebo uvolněné vodíkové ionty vybarví tetrazoliovou  sůl na formazan.

1.5.5. Imunohistochemie
 Užívá se k průkazu řady polypeptidických  hormonů, ale též k průkazu některých enzymů.  Principem je vazba proti-
látky proti sledovanému  antigenu (např. polypeptidu) a zobrazení této vazby.
 V zásadě je nutné získat protilátku proti  sledovanému antigenu. Protilátku získáme imunizací  zvířete (např. králíka)
antigenem. Ze séra zvířat  získáváme tzv. polyklonální protilátky. Druhou  možností je příprava tzv. monoklonálních
protilátek ve tkáňové kultuře, kde buňky (např. myšího)  myelomu od imunokompetentních buněk imunizovaného
zvířete získají kód pro tvorbu jediného typu protilátky. Každá z těchto technik má své výhody, ale  i nevýhody. Všeo-
becně, protilátky mají reagovat  specificky, a to v co nejvyšším ředění. (Prvou  technikou přímé imunizace můžeme
získat protilátky  o vysokém titru - sérum zvířat, která vždy spontánně tvoří velmi široké spektrum protilátek můžeme
tedy podstatně ředit tak, že tyto "nespecifické protilátky" se nemohou uplatnit, případně  specifické protilátky můžeme
ze séra izolovat.  Druhá technika dává vysoce specifické protilátky,  které však již nemůžeme tolik ředit a tyto protilátky
jsou velmi drahé.). Každá protilátka je  schopná reagovat se třemi až osmi aminokyselinami  (epitopy) v řetězci sledo-
vaného antigenu. Malé molekuly (např. o molekulové hmotnosti méně než  4.500) zpravidla nevyvolávají tvorbu proti-
látky.  Proto musí být před imunizací navázány na nosič.  Zakladatelem těchto technik je Albert H. Coons,  který k
vizualizaci vazby antigen-protilátka užíval přímo FITC (fluoresceinisothiocyanátem) značenou primární protilátku nebo
značil až sekundární  protilátku (protilátku proti druhu dárce primární  protilátky - v uváděném příkladu proti-králičí).
Protože fluorescenční průkazy vyžadují vybavení  laboratoře drahým fluorescenčním mikroskopem  a preparáty nejsou
trvalé, je v současné době užíváno značení např. křenovou peroxidázou (nebo jinými enzymy - alkalickou či kyselou
fosfatázou nebo glukosooxidázou). Modifikací těchto technik je  užívána celá řada. Na elektronmikroskopické úrovni
se v současné době užívá jako márkr koloidní roztok zlata, kde partikule jsou nejčastěji od 5 do  15 nm velké.
 Principiální provedení těchto technik je  následující: Řez studovanou tkání se převrství  kapkou primární protilátky (ve
vlhké komůrce, aby nedošlo k vyschnutí preparátu). Během několikahodinové inkubace dojde k vazbě sledovaného