skripta

¶ 8 ·

10 a,b,c demonstrují relativní hustotu radioaktivního značení 4 komponent  buněk Langerhansových ostrůvků, zúčast-
něných na  proteosyntéze (Viz Kap. 2. Cytologie str. 15). Současně  bylo zjištěno, že rychlost transportu je různá  v
různých typech buněk (rychlá v buňkách produkujících glukagon a inzulín, pomalá v buňkách produkujících soma-
tostatin-14). Naproti tomu poločas  přeměny prohormonu v hormon byl nejkratší u somatostatinu-14 (150 min.), jen
málo delší u inzulinu  (155 min.) a nejdelší u glukagonu (přes 300 min.).

1.7. Izolace buněčných komponent
 Podstatná  část našich znalostí o chemickém složení buněk a jejich organel, vychází z poznatků, které byly získány
jejich izolací. Prvně  takovou techniku užili Besley a Hoerr (1934)  k izolaci mitochondrií jaterní buňky.
 V prvé fázi této techniky je nutné získat ze  tkáně (jater, pankreatu a pod., kde tkáň je složena převážně z jediného typu
buněk) buněčnou suspenzi. Tuto získáme působením mírných mechanických  sil (homogenizátor, třepání a pod.) na
kousek tkáně ve fyziologickém roztoku, ku kterému byly přidány některé enzymy (např. kolagenáza nebo trypsin), které
působením na mezibuněčné složky tkáně  usnadní její rozvolnění a izolaci buněk. Dalším  přidáním fyziologického
roztoku snížíme koncentraci enzymu a tkáňovou suspenzi necháme sedimentovat  ve zkumavce. Asi po 20-ti minutách
sedimentace se  na dně zkumavky usadí zbytky vaziva a nerozvolněné  shluky buněk, v tekutině nad tímto sedimentem
(v supernatantu) se vznášejí jednotlivé buňky  a jejich uvolněné komponenty. Tuto první fázi obvykle opakujeme.
 V další fázi, po opětovné homogenizaci supernatantu v homogenizátoru, získáme suspenzi buněčných komponent. (Při
homogenizaci ochlazujeme  homogenzátor na cca 4° C.) Dále pak existují dvě  možnosti získání relativně čistých frakcí
buněčného obsahu: 1) frakcionová cetrifugace - tj.  centrifugace při různých urychleních (g) a časech  a 2) cetrifugace v
roztoku o různém gradientu. Takový sloupec o různém gradientu se  připraví opatrným navrstvením několika vrstev
(např. cukrosy nebo Percollu) o požadované specifické hmotnosti na sebe, nejtěžší na dno zkumavky,  nejlehčí nejvýše.
[Percoll je koloidní roztok silikagelu, jehož částice jsou povlečené polyvinyl  pyrolidonem - koncentrovaný roztok má
hustotu 1,13 g/ml. Požadované hustoty se připraví naředěním  Percollu některým kultivačním médiem - např. Earlovým
médiem.]. Sedimentace buněčných komponent je  podmíněna jejich velikostí, tvarem a specifickou  hmotností. Jako
nejvyšší vrstva se do centrifugační zkumavky přidá suspenze buněčných komponent.  Při centrifugaci pak uvolněné
buněčné komponenty  klesají a zastaví se ve vrstvě, která odpovídá jejich specifické hmotnosti.
 Takovými postupy je možné připravit relativně  velmi čisté suspenze jader, mitochondrií, lyzosomů, granul a tzv. mik-
rosomální frakci, což je název pro membrány s ribosomy a volné ribosomy.  Uvolnění ribosomů od membrán je možné
např. přidáním deoxycholátu sodného do média. Uvolněné ribosomy při opětovné centrifugaci klesnou níže a nad  nimi
je vrstvička membrán endoplazmatického retikula.
 Podobnými (gradientovými) technikami je možné  získat i různé typy buněk ze tkání složených z více buněčných typů
(např. z Langerhansových ostrůvků). Separované typy buněk (které se zpravidla  rozvolňují v médiu prostém kalcia,
případně za  přítomnosti EDTA nebo EGTA) můžeme pak pěstovat ve  tkáňových kulturách nebo opět homogenizovat a
komponenty buněk podrobit gradientové centrifugaci.
 [EDTA i EGTA jsou pro kalciové ionty chelatační  látky; EDTA je etylendiamin tetraoctová kyselina;  EGTA je ety-
lenglykol-bis(β-aminoetyléter)-N-N'-tetraoctová kyselina.]