skripta

Metody histologického studia

¶ 7 ·

antigenu s primární protilátkou. V další fázi průkazu,  po dokonalém vyprání nenavázané protilátky, je řez  převrstven
sekundární protilátkou (namířenou proti  imunoglobulinům dárce primární protilátky). Tato  sekundární protilátka může
být označena (FITC,  křenovou peroxidázou, alkalickou fosfatázou  a pod.). Po této inkubaci a opětovnémvyprání se-
kundární protilátky je v případě značení  FITC preparát, po zamontování do glycerinu hotový  a může být studován. V
případě enzymatického značení je nutno ještě vazbu vizualizovat (např.  u křenové peroxidázy diaminobenzidinem za
přítomnosti peroxidu vodíku). V současné době bývá užito  při průkazech ještě citlivějších metod, kdy sekundární pro-
tilátka se značí biotinem. Márker se naváže rovněž na biotin a vazbu biotinů zajistí avidin  (avidin-biotin-peroxidase-
complex - ABC techniky).
 Pro možnosti arteficielně pozitivních nálezů  je nutné současně provádět i některé kontrolní reakce (se sérem neimuni-
zovaného zvířete a se sérem imunizovaného zvířete, které bylo předem vysyceno sledovaným antigenem).
 Nejmodernější jsou hybridizační techniky  umožňující identifikaci specifických sekvencí DNA  či RNA. Principem je
schopnost jednopramenné nukleové kyseliny vázat předem značený komplementární  jednopramenný řetězec o známé
sekvenci nukleových  kyselin. Tyto řetězce o známé sekvenci jsou nazývány sondy (proby). Sondy bývají značené buď
radioizotopy nebo biotinem. Podle způsobu značení jsou  pak vizualizovány buď fotografickou emulzí (jako  při autora-
diografii - viz dále) nebo např. peroxidázou navázanou na avidin (avidin a biotin se spolu spojují - je užíváno i v imu-
nohistochemii).  Hybridizační techniky pro identifikaci génových  DNA nebo m-RNA jsou vysoce citlivé a jsou
schopné  identifikovat buňky chovající již více než 20 molekul m-RNA.

1.5.6. Lektiny
 V posledních letech byla rozpoznána možnost  prokazovat různé sacharidové zbytky, účastnící se  na stavbě, hlavně
zevního listu, povrchové buněčné  membrány, využitím lektinů.
 Lektiny jsou glykoproteiny vyskytující se jak  v říši rostlinné, tak živočišné. Jsou to tedy složité látky, které mají
schopnost vázat se na různé  sacharidové zbytky - zpravidla jeden lektin rozpoznává více sacharidů a tedy kombinací
různých  lektinů je možné určit sledovaný sacharid. Pojmenovávání lektinů vychází obvykle z latinských názvů rostlin,
z nichž byl takový lektin izolován  (např. lektin PSA je lektin z Pisum sativum  [hrachu] atd).
 Praktický význam nabývají tyto průkazy cukerných zbytků na biomembráně tím, že se tyto cukerné  zbytky mění nejen
během vyzrávání buňky, ale i při  jejím maligním (zhoubném) zvratu.
 Princip  průkazů je poměrně jednoduchý: buněčnou suspenzi nebo řez tkání převrstvíme kapkou  značeného lektinu
(např. značeného FITC - fluoresceinisothiocyanátem nebo některým enzymem  - např. křenovou peroxidázou a pod.),
po době nutné pro navázání nenavázaný lektin vypereme a při  použití FITC značení je preparát hotový - je nutno  jej
studovat ve fluorescenčním mikroskopu. Při  použití např. křenové peroxidázy či jiných enzymů,  je nutné tyto ještě
vybarvit (u křenové peroxidázy  diaminobenzidinem s přídavkem H2O2).