Biologie člověka

Sekvenace:

• Zjištění konkrétní sekvence vybraného úseku DNA řetězce

• Fragmenty DNA (řetězce) - rozlišení ve své délce i o jeden nukleotid

• Sangerova metoda - chemicky modifikované dNTP

  1. (deoxyribonukleosidtrifosfáty) na ddNTP (dideoxyribonukleosidtrifosfáty)

  2. ddNTP postrádají 3'-OH skupinu; za ddNTP si při elongaci už nemůže

  3. přisednout žádný dNTP - dojde k terminaci elongace

• PCR reakce:

  1. Zkoumaný fragment DNA; pufr, DNA-polymerasa a mix normálních dNTP

  2. Radioaktivně značený primer pro jedno vlákno DNA,

  3. Sekvenace se odehrává ve 4 reakčních směsích (ddATP; ddTTP; ddCTP; ddGTP - odlišně fluorescenčně značeny);

• Elektroforetická detekce fragmentů v gelu

RFLP – změna délky fragmentu:

• Základem RFLP je štěpení izolované DNA restrikčními endonukleázami. Běžně se používají takové, které štěpí tzv. palindromatické sekvence, tedy ty, které mají stejné pořadí basí, čteme-li je v opačných směrech od štěpného místa. Příkladem používaných enzymů může být EcoRI izolovaný z bakterie Escherichia coli, nebo HindIII (Haemophilus influenzae), HpaI (Haemophilus parainfluenzae), či AluI (Arthrobacter luteus). První dva jmenované enzymy stříhají molekulu DNA tak, že vznikají "lepivé, kohezní" konce (angl. sticky ends), užitím dalších dvou pak lze získat úseky DNA s "tupými" konci (angl. sticky ends).

• Restrikční místo enzymu EcoRI, oddělení sekvencí naznačeno zelenou čarou.

• Po štěpení DNA jedním nebo více restrikčními enzymy jsou vzniklé fragmenty separovány pomocí gelové elektroforézy (DNA má uniformní negativní náboj a její fragmenty putují od anody ke katodě, přičemž jejich mobilita závisí pouze na jejich velikosti). Získaný vzor na gelu nemusí být zřetelný, proto se cílí na vybrané úseky. Používá se tzv. "Southernův přenos" (angl. Southern blotting, the blotting paper = piják) k přenesení DNA z gelu na pevné médium, membránu z nitrocelulózy nebo nylonu, přičemž je zachována poloha jednotlivých fragmentů DNA. K membráně se přidá specifická jednovláknová sonda, tou může být definovaný gen nebo segment DNA či RNA známého původu označený radioaktivní chemikálií, či chemoluminiscenční látkou. Používají se buď lokusově specifické sondy (např. pro biosystematické studie rostlin je využívána ribozomální RNA), nebo multilokusové, schopné rozeznat opakující se sekvence (VNTR).

• U fragmentů, které jsou komplementární k DNA sondy, dojde k hybridizaci. Po následném vymytí zůstanou na membráně pouze ty, které hybridizovaly.

• Restrikční endonukleázy – restriktázy:

  • Enzymy, které štípou dvouvláknovou molekulu DNA uvnitř řetězce a to vždy v konkrétní pozici, charakteristické pro danou restriktázu (restrikční místo)

DNA hybridizace – blotting:

• Výkonným nástrojem pro rozdělování makromolekul s různou velikostí a nábojem je gelová elektroforéza