Vypracovane-otazky-ke-zkousce

Southernův přenos (Southern Blotting = „přepijákování)

• zkoumání velikosti restrikčních fragmentů urč.úseku DNA

1. izolace DNA (kvalita, kvantita?)

2. štěpení (restrikční endonukleázy)

3. elektroforéza (gelová) → přenesení na pevnější podložku – nitrocelulóza, nylonová membrána – vzlínáním pufru → blotting

4. fixace fragmentů na podložku + denaturace (80°C ve vakuu)

5. hybridizace s radioaktivně značenou sondou (komplementarita, ochlazení)

6. lokalizace hybridizovaných fragmentů autoradiograficky

7. odečtení

   • sondy: DNA z genových knihoven se známou lokalizací, alelně specifické sondy

DNA Fingerprinting („otisky prstů)

• při použití RFLP sondy zaměřené na mikrosatelitní DNA najdeme v lidské populaci vysoký stupeň polymorfismu restrikčních fragmentů, 10-20 pravděpodobnost dvou osob se stejným obrazem

• stanovování zygotnosti dvojčat, posuzování sporného otcovství,v kriminalistice - identifikaci stop tkání

16. METODY GENETICKÉ ANALÝZY V EXPERIMENTU A LIDSKÉ GENETICE

• lidská genetika – rodinné studie => 2 typy rodin – 1) málo velmi početných rodin

2) velký počet rodin s menším počtem členů

• v praxi – mezi geny vzdálenost menší než 10cM (LOD skóre > 3)

• klonování genu zaležené pouze na jeho pozici v mapě bez znalosti toho, jaká je fce genu, nebo jak může vypadat – poziční klonování

POZIČNÍ KLONOVÁNÍ

• s použitím strukturních chromosomových odchylek:

• Duchenova muskulární dystrofie

• X vázaný gen DMD, jehož mutace způsobuje Duchenovu muskulární dystrofii a méně závažnou Backerovu alelovou formu (BMD) => jeden z prvních genů lokalizovaných genetickou vazebnou analýzou (Xp21) a také jeden z prvních genů klonován pozičním postupem

• etické otázky – kdo má právo znát něčí genetickou informaci a jak ji smí použít => obava

z diskriminace zaměstnavatelem, zdravotní pojišťovnou

17. GENETICKÉ MAPOVÁNÍ U ČLOVĚKA

• nejstarší metody genetického mapování – vychází z genové vazby

• v případě, že lokusy genů leží na stejném chromosomu, převládají v potomstvu rodičovské sestavy alel

• v daleko menší míře – zastoupení nových sestav alel vzniklých crossing-overem při meiotickém dělení

• frekvence odpovídá vzdálenosti příslušných genů

↓

čím je zastoupení rekombinantních sestav vyšší, tím jsou geny vzdálenější

mapová vzdálenost R

p = ---------------- *100

N + R

R – počet rekombinantních potomků

N – počet potomků s původní rodičovskou sestavou alel

p – Morganovo číslo – vzdálenost genů v mapových jednotkách neboli cM

- v lidském genomu odpovídá 1cM zhruba 1 milion párů bazí

• člověk – cca 35 000 – 40 000 genů

• 2 odlišné způsoby mapování – fyzikální – nízká rozlišovací schopnost -> vytogenetické pruhování

metafazních chromosomů

- vysoká – určení polohy a vzdálenosti jednotlivých genů

- genetické – vazebná analýza