Vypracovane-otazky-ke-zkousce

PŘÍČINY POLYMORFISMŮ DNA

• polymorfismy DNA  způsobeny mutacemi, které vznikají v zárodečných nebo somatických buňkách organismu  jestliže mutace nenarušují schopnost reprodukce, jsou předávány do další generace  o polymorfismu DNA hovoříme v případě, že se vzniklá varianta (alela) vyskytuje v populaci s frekvencí větší než 0,01

• většina lidské DNA se nachází v nekódujících oblastech a proto není selektována  asi proto nejsou rozdíly v těchto sekvencích DNA mezi jedinci vzácné; obvykle se jedná o jednoduché záměny bazí

• termín polymorfismus je někdy nesprávně používán pro označení sekvenčních změn, které nezpůsobují onemocnění, na rozdíl od termínu mutace, které jsou příčinou změny fenotypu

• analýza variací v nukleotidové sekvenci DNA je důležitá, protože přispívá k identifikaci lidských genů zodpovědných za postižení a následně je lze využít k DNA diagnostice v postižené rodině i k identifikaci jedince např. ve forenzní genetice

50. METODY ANALÝZY NUKLEOVÝCH KYSELIN

1. DNA

   • revoluční technologie  vznikají rekombinantní molekuly DNA  základ pro studium

   • aplikace: analýza struktury genu, mapování, funkce

analýza geneticky podmíněných onemocnění

• prenatální diagnostika

• detekce nosičů mutovaných alel

• diagnostika a patogeneze onemocnění

biosyntéza – insulin, růstový hormon, ……

léčba genetických onemocnění – genová terapie

• základní objev pro rozvoj  objev enzymů = tzv. restrikční endonukleasy (restriktasy)  z bakterií  schopnost štěpit dsDNA ve specifických místech daných určitou sekvencí nukleotidů

  • většinou jde o palindromy

  • restriktasy jsou třeba k získání dostatečného množství

• k získání dostatečného množství DNA

  • klonování  DNA kterou chceme namnožit vpravíme pomocí vektoru do prostředí  vektor a lidskou DNA rozštěpíme stejným způsobem  smísení obou molekul DNA  dimerická molekula

  • snadnější namnožení DNA– fragmentů  PCR (polymerázová řetězová reakce) = mnohokrát opakovaná replikace DNA in vitro s tím, že každá replikovaná molekula DNA slouží jako templát:  denaturovaná DNA  nasednutí primeru  syntéza DNA

• hybridizační techniky  k hledání daného fragmentu  potřebujeme tzv. sondu = tzv. Southern blotting

  • dsDNA  ssDNA; označená sonda  rozštěpení enzymy na fragmenty  elektroforesa v agarovém gelu  přenos na nitrocelulosu  fixace DNA  kontakt se sondou (cDNA n RNA značená 32P)  fragmenty DNA, které hybridizovaly se sondou

  • in situ hybridizace sondy k určení polohy specifických nukleotidových sekvencí uvnitř buňky nebo na chromosomech; sondy značené fluorescenčními barvivy nebo radioaktivními izotopy

  • RFLP (Restriction Fragment Lenth Polymorfism) – polymorfismus v délce restrikčních fragmentů  gelová elektroforesa  pozorování jednotlivých restrikčních fragmentů v UV-světle nebo po obarvení (ethidiumbromid)