Vypracovane-otazky-ke-zkousce

• Chemické nebo enzymatické štěpení heteroduplexu

• metoda založená na detekci heteroduplexů, které jsou po smísení testované a kontrolní standardní sekvence DNA připraveny stejným způsobem jako u HA

• používají se chemikálie (hydroxylamin, piperidin, OsO4) nebo enzymy bakteriofágů (uplatňují se v opravném systému DNA), které jsou schopny štěpit heteroduplex v místě, kde není úplná komplementarita obou vláken

• elektroforéza pak prokáže přitomnost štěpených nebo neštěpených fragmentů testovaného řetězce DNA

• metoda je velmi citlivá

• umožňuje odhadnout pozici mutace podle velikosti štěpeného fragmentu

• používané chemikálie jsou velmi toxické a metoda se nevyužívá v diagnostické praxi

• Metoda SSCP

• založena na analýze ssDNA

• ssDNA má tendenci vytvářet třírozměrnou strukturu (konformaci) stabilizovanou slabými intramolekulárními vazbami (H-můstky)

• elektroforetická mobilita takových struktur v gelu závisí na jejich délce a jejich konformaci, která je dána složením sekvence DNA

• metoda využívá metody PCR

• amplifikovaný úsek DNA je denaturován a nanesen na polyakrylamidový gel

• jestliže je ve vyšetřovaném úseku DNA přítomna mutace, pak ssDNA zaujmou odlišnou konformaci → odlišná pohyblivost v gelu ve srovnání s kontrolními vzorky vlíken DNA

• vizualizace vláken DNA – stříbřením, radioaktivním značením oligonukleotidů pro PCR

• méně citlivá metoda než DGGE

• Metoda PTT

• specifická pro detekci mutací, které mají za následek vznik předčasného terminačního kodonu a tím zkrácení proteinového produktu

• z izolované RNA (mRNA) je reverzní transkripcí a následnou PCR připravena cDNA a pak je provedena transkripce a translace in vitro

• velikost proteinového produktu je testována elektroforeticky a srovnána s délkou standardního produktu

• pro vyšetření těch genů, kde se vyskytují mutace posunové a nesmyslné, ve kterých jsou vzácné mutace měnící smysl kodonu

• podle velikosti proteinového produktu lze určit přibližnou lokalizaci detekovaných mutací ve vyšetřovaném genu

• Metody sekvenování

• spolehlivě odhalí odchylky v nukleotidové sekvenci DNA

• velmi pracné a drahé

• používá se většinou v závěrečné fázi vyšetření genu – je sekvenován pouze úsek genu s prokázanou mutací

Metody detekce specifických mutací

• vyšetření vzorku DNA na přítomnost známé specifické mutace

• lze použít u onemocnění, kde má většina postižených osob 1 nebo omezený počet mutací (srpkovitá anémie, cystická fibrosa, achondroplasie

• PCR – RFLP

• v případech, kdy mutace vytváří nebo ruší restrikční místo pro určitý restrikční enzym

• metodou PCR se amplifikuje úsek DNA s restrikčním místem, pak následuje restrikce specifickým restrikčním enzymem a gelová elektroforéza

• velikost produktů PCR zištěná na gelu odhalí přítomnost nebo absenci mutace v dané sekvenci

• ASO

• alelně specifické oligonukleotidy – syntetizovány k detekci bodové nukleotidové diference v sekvenci DNA

• krátké řetězce 15-19 nukleotidů komplementární k části sekvence genu, která obsahuje místo se záměnou nukleotidu

• po označení je lze použít jako krátké sondy DNA, které hybridizují s amplifikovanou cílovou DNA

• používají se obě možné sekvence ASO dané oblasti – komplementární k standardní DNA a k mutantní sekvenci DNA

• každá sonda je hybridizována s testovanou DNA separátně

• lze využít Southern blot nebo bodovou hybridizaci (na nitrocelulózovou nebo nylonovou membránu se nanese vodný roztok testované DNA a vysušen, po denaturaci a hybridizaci se značenou sondou následuje autoradiografie)

• použití ASO umožňuje hybridizaci s komplementární DNA, ale s DNA, kde je bodová mutace, k hybridizaci nedochází