Vypracovane-otazky-ke-zkousce

Diagnostika expanze trinukleotidů

• Huntington – amplifikace oblasti genu s repeticemi (CAG)n a elektroforéza produktů PCR

v polyakrylamidovém gelu

- počet repetic souvisí s rozvojem onemocnění

• Syndrom fragilního X – podmíněn expanzí repetice CGG

- detekce Southern hybridizací

• začíná v úsecích genu s nejvyšším výskytem mutací a při negativním výsledku pokračuje postupným testováním všech úseků genu, po zjištění mutace u postiženého jsou vyšetřeni ostatní členové rodiny cíleně na výskyt této mutace

63. NEPŘÍMÁ DIAGNOSTIKA DĚDIČNÝCH CHOROB ANALÝZOU NUKLEOVÝCH KYSELIN

• ja známa lokalizace genu, ale nemusí být známa jeho přesná nukleotidová sekvence, nebo dosud nejsou charakterizovány jeho mutace zodpovědné za vznik onemocnění

• využívá vazebné analýzy pomocí signálních znaků DNA (DNA markerů)

• markery – polymorfismy DNA, které jsou lokalizovány v těsném sousedství nebo uvnitř sledovaného

genu a s vlastním onemocěním nesouvisejí

- RFLP – detekce PCR

- VNTR (Variable number of tandem repeats) – variabilní minisatelitní sekvence – detekce

pomocí Southern blotting

- DNA fingerprinting – při analáze RFLP – použijeme sondu zaměřenou na

minisatelitní DNA – vysoký stupeň polymorfismu restrikčních fragmentů v lidské

populaci

- mikrosatelity (SSRs – single sequence repeats)

• 1. diagnostika na úrovni analýzy DNA

• vychází z rodové studie, při které jsou použity markery vázané s genem, jehož mutace způsobují onemocnění v rodině

• tyto markery jsou spolu se sledovaným genem přenášeny z rodičů na potomky

• cílem:

1. rozlišit chromosomy rodičů, z nichž jeden může přenášet mutovaný gen – najít polymorfismus, který je ve vazbě se sledovaným genem, a pro který je rodič heterozygot

2. zjistit, která z alel markeru segreguje s mutovanou alelou sledovaného genu – můžeme to zjistit vyšetřením dalších příbuzných v rodině, postižených i zdravých

3. pomocí zvolených markerů zjistit, který chromosom byl přenesen na probanda, eventualně na další členy rodiny, zejména osoby v riziku

   • musí být vyšetřeny vzorky DNA co největšího počtu členů rodiny – vyšetření musí být nejméně 2 postižení v rodině a další příbuzní včetně zdravých partnerů => jen tak je možné sledovat segregaci chromosomů se zvoleným polymorfismem DNA a mutací ve sledovaném genu => pak je možné určit, zda osoby v riziku zdědily mutantní či normální alelu s vysokou pravděpodobností, která je závislá na síle vazby mezi markerem a sledovaným genem

   • vazebná studie => nemůžeme opomenout možnost rekombinace mezi sledovaným genem a markerem – vhodné použít intragenový marker, kde je pst rekombinace minimální

   • velikost chyby v diagnóze v důsledku rekombinace může být značně zredukována tím, že jsou použity 2 markery lokalizované na opačných koncích sledovaného genu – vzniklou rekombinaci lze pomocí nich zjistit a vyloučit falešnou predikci

   • metoda je rychlá a spolehlivá

   • markery vázané se sledovaným genem, zjištěné u matky a otce, nejsou vždy odlišné (tj. jedinec je pro ně homozygotní) a vyšetření potom není informativní

   • provedení nepřímé DNA diagnostiky je závislé na dostupnosti DNA rodičů a dalších příbuzných probanda