Vypracovane-otazky-ke-zkousce

Poslední nově zkoušený lék proti AIDS, lamivudin, nezpůsobuje žádné poškození mitochondrií, což odpovídá minimu nežádoucích účinků, které vyvolává u pacientů.

21.4 Mitotoxiny

Na obrázku 2 a 3 je uveden přehled látek poškozujících mitochondriální funkce.

62. PŘÍMÁ DIAGNOSTIKA DĚDIČNÝCH CHOROB ANALÝZOU NUKLEOVÝCH KYSELIN

• umožňuje zachytit a identifikovat mutaci zodpovědnou za onemocnění u postižených ve sledované rodině

• zjistí, zda DNA testované osoby nese gen normální nebo mutovaný

• detekce mutací v odpovědném genu vždy potvrdí klinickou diagnózu

• podmínkou je znalost lokalizace genu a znalost jeho standardní sekvence

• mutantní fenotyp závisí na lokalizaci mutace v genu a typu mutace

• je preferovaná, protože umožňuje stanovit přesně typ mutace a nevyžaduje vzroky mnoha členů rodiny

• metody přímé diagnostiky pracují buď s oligonukleotidovými sondami nebo využívají metod sekvenování zkoumaného genu  možnost odhalení heterozygotního přenašeče mutované alely i u jedince v jejichž příbuzenstvu postižený jedinec není znám

• metody jsou citlivé, ale pracné a drahé

METODY DETEKCE MUTACÍ

• většinou stanoví rozdíly mezi sekvencí DNA pacienta a popsanou standardní sekvencí, aniž rozlišují mezi fenotypovými projevy

Metody testující jakoukoliv odchylku od standardní sekvence DNA

• většina metod používá PCR

• převážnou část genů nelze díky jejich velikosti vyšetřit v 1 reakci → jsou pomocí zvolených párů primerů postupně amplifikovány jednotlivé úseky genu

• počet amplifikovaných oblastí je závislý na velikosti genu

• u středně velkých genů (tisíce bp) může vyšetření kódující oblasti genu vyžadovat více než 50 amplifikačních reakcí

• amplifikované úseky jsou pak vyšetřeny některou z následujících metod

• Heteroduplexní analýza

• založena na detekci chybného párování bazí, ke kterému dochází při hybridizaci komplementárních vláken DNA standardního a mutantního typu

• vznikají hybridní molekuly DNA = heteroduplexy

• heteroduplexy se tvoří v místech s delecemi nebo inzercemi několika bází i v místech se substitucemi 1 nebo několika nukleotidů

• mohou vznikat již v průběhu PCR, když testovaná DNA obsahuje 2 různé alely

• lze je připravit tepelnou denaturací produktu PCR a následným zchlazením na teplotu, při které dochází k renaturaci – výsledkem je vznik 2 typů homoduplexů – standardního a mutantního, a 2 různých heteroduplexů

• při detekci mutací v homozygotním stavu nebo mutací X-vázaných je nutné smísit produkty PCR standardní a mutantní DNA a opět provést denaturaci a renaturaci DNA

• přítomnost heteroduplexů lze odhalit elektroforézou v polyakrylamidovém gelu – pohyb heteroduplexů je pomalejší než pohyb homoduplexů

• tvorba heteroduplexů a jejich stabilita závisí na typu mutace ve fragmentu PCR

• Metoda DGGE

• založena také na analýze heteroduplexů

• heteroduplexy a homoduplexy připravené podobným postupem jako u HA migrují při elektroforéze gelem, který obsahuje lineárně se zvyšující množství denaturačních činidel (urea a formamid)

• elektroforéza probíhá při konstantní zvýšené teplotě

• migrace pokračuje až do místa v gelu, kde se vlákna DNA začínají od sebe separovat – v místě, kde koncentrace denaturačních činidel odpovídá teplotě (Tm), při které dochází k částečné denaturaci vyšetřovaného fragmentu DNA

• Tm – teplota, kdy je polovina vláken dvoušroubovice DNA disociovaná nebo denaturovaná

• migrace parciálně denaturovaného fragmentu DNA se značně zpomalí nebo zastaví, DNA heteroduplexy jsou méně stabilní a proto se jejich vlákna častečně separují dříve než vlákna homodulexů → zpomalí svou mobilitu v gelu a migrují do jiné pozice

• za optimálních podmínek je DGGE vysoce citlivá metoda, která zachytí delece a inzerce, i diference v 1 páru bazí (substituce) mezi standardním a mutantním vláknem DNA